etkili bir şekildesivrisinekleri kontrol etmekTaşıdıkları hastalıkların görülme sıklığını azaltmak için, kimyasal böcek ilaçlarına stratejik, sürdürülebilir ve çevre dostu alternatiflere ihtiyaç duyulmaktadır. Mısır Aedes (L., 1762) sivrisineğinin kontrolünde kullanılmak üzere, biyolojik olarak aktif olmayan glukosinolatların enzimatik hidroliziyle üretilen bitki kaynaklı izotiyosiyanatların kaynağı olarak bazı Brassicaceae (Brassica familyası) türlerinin tohum unlarını değerlendirdik. Beş farklı yağdan arındırılmış tohum unu (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ve Thlaspi arvense – üç ana termal inaktivasyon ve enzimatik bozunma türü) Kimyasal ürünler. Allyl izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanatın Aedes aegypti larvalarına 24 saatlik maruz kalma süresinde (0,04 g/120 ml dH2O) toksisitesini (LC50) belirlemek için. Hardal, beyaz hardal ve atkuyruğu için LC50 değerleri. Yonca tohumu unu, sırasıyla 0,05, 0,08 ve 0,05 oranlarında, allil izotiyosiyanat (LC50 = 19,35 ppm) ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat (LC50 = 55,41 ppm) ile karşılaştırıldığında, 24 saatlik işlemden sonra larvalar için 0,1 g/120 ml dH2O'dan daha toksikti. Bu sonuçlar, yonca tohumu ununun üretimiyle tutarlıdır. Benzil esterlerin daha yüksek etkinliği, hesaplanan LC50 değerleriyle örtüşmektedir. Tohum unu kullanımı, sivrisinek kontrolü için etkili bir yöntem sağlayabilir. Turpgiller tohumu tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliği ve turpgiller tohumu tozundaki doğal bileşiklerin sivrisinek kontrolü için umut vadeden çevre dostu bir larvisit olarak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Aedes sivrisineklerinin neden olduğu vektör kaynaklı hastalıklar, küresel ölçekte önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Sivrisinek kaynaklı hastalıkların görülme sıklığı coğrafi olarak yayılmakta1,2,3 ve yeniden ortaya çıkarak ciddi hastalık salgınlarına yol açmaktadır4,5,6,7. İnsanlar ve hayvanlar arasında hastalıkların yayılması (örneğin, chikungunya, dang humması, Rift Vadisi humması, sarı humma ve Zika virüsü) eşi benzeri görülmemiş bir boyuttadır. Sadece dang humması bile tropik bölgelerde yaklaşık 3,6 milyar insanı enfeksiyon riski altına sokmakta ve yılda tahmini 390 milyon enfeksiyona ve 6.100-24.300 ölüme neden olmaktadır8. Güney Amerika'da Zika virüsünün yeniden ortaya çıkması ve salgını, enfekte kadınlardan doğan çocuklarda neden olduğu beyin hasarı nedeniyle dünya çapında dikkat çekmiştir2. Kremer ve ark.3, Aedes sivrisineklerinin coğrafi yayılım alanının genişlemeye devam edeceğini ve 2050 yılına kadar dünya nüfusunun yarısının sivrisinek kaynaklı arbovirüsler nedeniyle enfeksiyon riski altında olacağını tahmin etmektedir.
Son zamanlarda geliştirilen dang humması ve sarı humma aşıları hariç, sivrisinek kaynaklı hastalıkların çoğuna karşı henüz aşı geliştirilmemiştir9,10,11. Aşılar hala sınırlı miktarlarda mevcuttur ve yalnızca klinik denemelerde kullanılmaktadır. Sentetik böcek ilaçları kullanılarak sivrisinek vektörlerinin kontrolü, sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasını kontrol etmenin temel stratejilerinden biri olmuştur12,13. Sentetik böcek ilaçları sivrisinekleri öldürmede etkili olsa da, sentetik böcek ilaçlarının sürekli kullanımı hedef olmayan organizmaları olumsuz etkiler ve çevreyi kirletir14,15,16. Daha da endişe verici olan, sivrisineklerin kimyasal böcek ilaçlarına karşı direncinin artması eğilimidir17,18,19. Böcek ilaçlarıyla ilgili bu sorunlar, hastalık vektörlerini kontrol etmek için etkili ve çevre dostu alternatiflerin aranmasını hızlandırmıştır.
Çeşitli bitkiler, zararlı böcek kontrolü için fitopestisit kaynakları olarak geliştirilmiştir20,21. Bitkisel maddeler genellikle biyolojik olarak parçalanabilir oldukları ve memeliler, balıklar ve amfibiler gibi hedef olmayan organizmalara karşı düşük veya ihmal edilebilir toksisiteye sahip oldukları için çevre dostudur20,22. Bitkisel preparatların, sivrisineklerin farklı yaşam evrelerini etkili bir şekilde kontrol etmek için farklı etki mekanizmalarına sahip çeşitli biyoaktif bileşikler ürettiği bilinmektedir23,24,25,26. Esansiyel yağlar ve diğer aktif bitki bileşenleri gibi bitki kaynaklı bileşikler dikkat çekmiş ve sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi araçların yolunu açmıştır. Esansiyel yağlar, monoterpenler ve seskiterpenler, kovucu, beslenme caydırıcı ve yumurta öldürücü olarak etki eder27,28,29,30,31,32,33. Birçok bitkisel yağ, sivrisinek larvalarının, pupalarının ve yetişkinlerinin ölümüne neden olur34,35,36 ve böceklerin sinir, solunum, endokrin ve diğer önemli sistemlerini etkiler37.
Son çalışmalar, hardal bitkilerinin ve tohumlarının biyoaktif bileşik kaynağı olarak potansiyel kullanımına dair bilgiler sağlamıştır. Hardal tohumu unu, biyofumigant38,39,40,41 olarak test edilmiş ve yabancı ot baskılaması42,43,44 ve toprak kaynaklı bitki patojenlerinin kontrolü45,46,47,48,49,50, bitki beslenmesi, nematodlar 41,51, 52, 53, 54 ve zararlılar 55, 56, 57, 58, 59, 60 için toprak iyileştirici olarak kullanılmıştır. Bu tohum tozlarının fungisidal aktivitesi, izotiyosiyanatlar38,42,60 adı verilen bitki koruyucu bileşiklere atfedilir. Bitkilerde bu koruyucu bileşikler, bitki hücrelerinde biyoaktif olmayan glukosinolatlar şeklinde depolanır. Ancak bitkiler böcek beslenmesi veya patojen enfeksiyonu nedeniyle zarar gördüğünde, glukosinolatlar mirosinaz tarafından biyolojik olarak aktif izotiyosiyanatlara hidrolize edilir55,61. İzotiyosiyanatlar, geniş spektrumlu antimikrobiyal ve insektisit aktiviteye sahip olduğu bilinen uçucu bileşiklerdir ve yapıları, biyolojik aktiviteleri ve içerikleri Brassicaceae türleri arasında büyük ölçüde değişiklik gösterir42,59,62,63.
Hardal tohumu unundan elde edilen izotiyosiyanatların böcek öldürücü aktiviteye sahip olduğu bilinmesine rağmen, tıbbi açıdan önemli eklembacaklı vektörlere karşı biyolojik aktiviteye ilişkin veriler eksiktir. Çalışmamızda, dört yağsızlaştırılmış tohum tozunun Aedes sivrisineklerine karşı larvasit aktivitesi incelenmiştir. Çalışmanın amacı, sivrisinek kontrolü için çevre dostu biyopestisitler olarak potansiyel kullanımlarını değerlendirmektir. Tohum ununun üç ana kimyasal bileşeni olan allil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat (4-HBITC) de bu kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvaları üzerindeki biyolojik aktivitesini test etmek için incelenmiştir. Bu, dört lahana tohumu tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliğini değerlendiren ilk rapordur.
Aedes aegypti (Rockefeller suşu) laboratuvar kolonileri 26°C, %70 bağıl nem (RH) ve 10:14 saat (aydınlık:karanlık) fotoperiyodunda muhafaza edildi. Çiftleşmiş dişiler plastik kafeslerde (yükseklik 11 cm ve çap 9,5 cm) barındırıldı ve sitratlı sığır kanı (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, ABD) kullanılarak bir biberon besleme sistemiyle beslendi. Kan beslemesi, sıcaklık kontrolü 37 °C olan bir sirkülasyonlu su banyosu tüpüne (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, ABD) bağlı bir membran çoklu cam besleyici (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, ABD) kullanılarak her zamanki gibi gerçekleştirildi. Her bir cam besleme haznesinin (alan 154 mm2) altına bir Parafilm M filmi gerildi. Daha sonra her besleyici, çiftleşen dişiyi içeren kafesin üst ızgarasına yerleştirildi. Bir Pasteur pipeti (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak cam bir besleme hunisine yaklaşık 350–400 μl sığır kanı eklendi ve yetişkin solucanların en az bir saat süzülmesine izin verildi. Daha sonra hamile dişilere %10'luk bir sakkaroz çözeltisi verildi ve ayrı ayrı ultra şeffaf sufle kaplarına (1,25 fl oz boyutunda, Dart Container Corp., Mason, MI, ABD) yerleştirilmiş nemli filtre kağıdı üzerine yumurta bırakmalarına izin verildi. Yumurtaları içeren filtre kağıdı, kapalı bir torbaya (SC Johnsons, Racine, WI) konuldu ve 26°C'de saklandı. Yumurtalar kuluçkalandı ve yaklaşık 200–250 larva, tavşan yemi (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ABD) ve karaciğer tozu (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ABD) karışımı içeren plastik tepsilerde yetiştirildi. ve balık filetosu (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Almanya) 2:1:1 oranında karıştırıldı. Biyolojik testlerimizde üçüncü evrenin sonlarına doğru olan larvalar kullanıldı.
Bu çalışmada kullanılan bitki tohumu materyali aşağıdaki ticari ve devlet kaynaklarından temin edilmiştir: Brassica juncea (kahverengi hardal-Pacific Gold) ve Brassica juncea (beyaz hardal-Ida Gold) Pasifik Kuzeybatı Çiftçiler Kooperatifi, Washington Eyaleti, ABD'den; (Bahçe Tereotu) Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, ABD'den ve Thlaspi arvense (Tarla Tereotu-Elisabeth) USDA-ARS, Peoria, IL, ABD'den. Çalışmada kullanılan tohumların hiçbiri pestisitlerle işlem görmemiştir. Tüm tohum materyali, yerel ve ulusal düzenlemelere ve ilgili tüm yerel, eyalet ve ulusal düzenlemelere uygun olarak işlenmiş ve bu çalışmada kullanılmıştır. Bu çalışma, transgenik bitki çeşitlerini incelememiştir.
Brassica juncea (PG), Yonca (Ls), Beyaz hardal (IG), Thlaspi arvense (DFP) tohumları, 0,75 mm elek ve paslanmaz çelik rotor, 12 diş, 10.000 rpm ile donatılmış bir Retsch ZM200 ultra santrifüj değirmeni (Retsch, Haan, Almanya) kullanılarak ince bir toz haline getirildi (Tablo 1). Öğütülmüş tohum tozu bir kağıt yüksüğe aktarıldı ve 24 saat boyunca Soxhlet cihazında heksan ile yağdan arındırıldı. Yağdan arındırılmış tarla hardalının bir alt örneği, mirosinazı denatüre etmek ve glukosinolatların biyolojik olarak aktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizini önlemek için 100 °C'de 1 saat süreyle ısıl işleme tabi tutuldu. Isıl işleme tabi tutulmuş atkuyruğu tohumu tozu (DFP-HT), mirosinazı denatüre ederek negatif kontrol olarak kullanıldı.
Yağdan arındırılmış tohum ununun glukosinolat içeriği, daha önce yayınlanmış bir protokole göre yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak üçlü tekrarlarla belirlendi. 64 Kısaca, 250 mg yağdan arındırılmış tohum tozu örneğine 3 mL metanol eklendi. Her örnek, su banyosunda 30 dakika boyunca ultrasonik işlemden geçirildi ve 23°C'de 16 saat boyunca karanlıkta bırakıldı. Daha sonra organik tabakanın 1 mL'lik bir kısmı, 0,45 μm'lik bir filtreden geçirilerek otomatik örnekleyiciye süzüldü. Bir Shimadzu HPLC sistemi (iki LC 20AD pompa; SIL 20A otomatik örnekleyici; DGU 20As gaz giderici; 237 nm'de izleme için SPD-20A UV-VIS dedektörü; ve CBM-20A iletişim veri yolu modülü) üzerinde çalıştırılarak, tohum ununun glukosinolat içeriği üçlü tekrarlarla belirlendi. Shimadzu LC Solution yazılımı sürüm 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, ABD) kullanıldı. Kolon, C18 Inertsil ters faz kolonuydu (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ABD). Başlangıçtaki mobil faz koşulları, 1 mL/dakika akış hızıyla %12 metanol/%88 0,01 M tetrabutilamonyum hidroksit (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) olarak ayarlandı. 15 μl numune enjekte edildikten sonra, başlangıç koşulları 20 dakika boyunca korundu ve ardından çözücü oranı %100 metanole ayarlandı; toplam numune analiz süresi 65 dakika oldu. Yağdan arındırılmış tohum ununun kükürt içeriğini tahmin etmek için, yeni hazırlanmış sinapin, glukosinolat ve mirosin standartlarının (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) seri seyreltmeleriyle standart bir eğri (nM/mAb bazlı) oluşturuldu. Örneklerdeki glukosinolat konsantrasyonları, aynı kolonla donatılmış ve daha önce açıklanan bir yöntem kullanılarak, OpenLAB CDS ChemStation sürümü (C.01.07 SR2 [255]) ile bir Agilent 1100 HPLC'de (Agilent, Santa Clara, CA, ABD) test edildi. Glukosinolat konsantrasyonları belirlendi; HPLC sistemleri arasında karşılaştırılabilir olması amaçlandı.
Allil izotiyosiyanat (%94, kararlı) ve benzil izotiyosiyanat (%98) Fisher Scientific'ten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) satın alındı. 4-Hidroksibenzilizotiyosiyanat ise ChemCruz'dan (Santa Cruz Biotechnology, CA, ABD) satın alındı. Glukosinolatlar, glukosinolatlar ve glukosinolatlar, mirosinaz enzimi tarafından hidrolize edildiğinde sırasıyla allil izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat oluştururlar.
Laboratuvar biyolojik testleri, Muturi ve ark. 32'nin yöntemine göre, bazı değişikliklerle gerçekleştirildi. Çalışmada beş düşük yağlı tohum yemi kullanıldı: DFP, DFP-HT, IG, PG ve Ls. Yirmi larva, 120 mL deiyonize su (dH2O) içeren 400 mL'lik tek kullanımlık üç yollu bir behere (VWR International, LLC, Radnor, PA, ABD) yerleştirildi. Sivrisinek larvaları üzerindeki toksisite için yedi farklı tohum unu konsantrasyonu test edildi: DFP tohum unu, DFP-HT, IG ve PG için sırasıyla 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 ve 0,12 g tohum unu/120 ml dH2O. Ön biyolojik testler, yağsızlaştırılmış Ls tohum ununun test edilen diğer dört tohum unundan daha toksik olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Ls tohum unu için yedi farklı uygulama konsantrasyonunu aşağıdaki konsantrasyonlara ayarladık: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 ve 0,075 g/120 mL dH2O.
Deney koşulları altında normal böcek ölüm oranını değerlendirmek için, işlem görmemiş bir kontrol grubu (dH20, tohum unu takviyesi yok) dahil edildi. Her bir tohum unu için toksikolojik biyolojik testler, toplam 108 şişe için üç tekrarlı üç eğimli beher (beher başına 20 geç üçüncü evre larva) içeriyordu. İşlem görmüş kaplar oda sıcaklığında (20-21°C) saklandı ve larva ölüm oranı, işlem konsantrasyonlarına sürekli maruz kalmanın 24 ve 72 saati boyunca kaydedildi. Sivrisineğin vücudu ve uzuvları ince bir paslanmaz çelik spatula ile delindiğinde veya dokunulduğunda hareket etmiyorsa, sivrisinek larvaları ölü kabul edilir. Ölü larvalar genellikle kabın dibinde veya su yüzeyinde sırtüstü veya karın pozisyonunda hareketsiz kalırlar. Deney, farklı larva grupları kullanılarak farklı günlerde üç kez tekrarlandı ve her bir işlem konsantrasyonuna toplam 180 larva maruz bırakıldı.
AITC, BITC ve 4-HBITC'nin sivrisinek larvalarına olan toksisitesi, aynı biyolojik test prosedürü kullanılarak ancak farklı uygulamalarla değerlendirildi. Her bir kimyasal için 100.000 ppm'lik stok çözeltileri hazırlamak için, 2 mL'lik santrifüj tüpüne 900 µL mutlak etanole 100 µL kimyasal ekleyin ve iyice karıştırmak için 30 saniye çalkalayın. Uygulama konsantrasyonları, BITC'nin AITC ve 4-HBITC'den çok daha toksik olduğunu bulan ön biyolojik testlerimize dayanarak belirlendi. Toksisiteyi belirlemek için, BITC'nin 5 konsantrasyonu (1, 3, 6, 9 ve 12 ppm), AITC'nin 7 konsantrasyonu (5, 10, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) ve 4-HBITC'nin 6 konsantrasyonu (15, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) kullanıldı. 30, 45, 60, 75 ve 90 ppm). Kontrol grubuna, kimyasal işlemin maksimum hacmine eşdeğer olan 108 μL saf etanol enjekte edildi. Biyoanalizler yukarıdaki gibi tekrarlandı ve her bir işlem konsantrasyonu için toplam 180 larva maruz bırakıldı. AITC, BITC ve 4-HBITC'nin her bir konsantrasyonu için 24 saatlik sürekli maruz kalmanın ardından larva ölüm oranı kaydedildi.
65 dozla ilişkili ölüm verisinin probit analizi, Polo yazılımı (Polo Plus, LeOra Software, sürüm 1.0) kullanılarak, logaritmik olarak dönüştürülmüş konsantrasyon ve doz-ölüm eğrileri için ölümcül doz oranlarının güven aralıklarına dayanarak %50 ölümcül konsantrasyon (LC50), %90 ölümcül konsantrasyon (LC90), eğim, ölümcül doz katsayısı ve %95 ölümcül konsantrasyon hesaplamak için gerçekleştirildi. Ölüm verileri, her bir tedavi konsantrasyonuna maruz kalan 180 larvanın birleştirilmiş tekrarlanan verilerine dayanmaktadır. Olasılık analizleri, her bir tohum unu ve her bir kimyasal bileşen için ayrı ayrı yapıldı. Ölümcül doz oranının %95 güven aralığına dayanarak, tohum unu ve kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvalarına olan toksisitesinin önemli ölçüde farklı olduğu kabul edildi, bu nedenle 1 değerini içeren bir güven aralığı önemli ölçüde farklı değildi, P = 0,0566.
Tablo 1'de, yağdan arındırılmış tohum unları DFP, IG, PG ve Ls'deki başlıca glukosinolatların belirlenmesine ilişkin HPLC sonuçları listelenmiştir. Test edilen tohum unlarındaki başlıca glukosinolatlar, her ikisi de mirosinaz glukosinolatları içeren DFP ve PG hariç, farklılık göstermiştir. PG'deki mirosin içeriği, DFP'ye göre daha yüksek olup sırasıyla 33,3 ± 1,5 ve 26,5 ± 0,9 mg/g'dir. Ls tohum tozu 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikon içerirken, IG tohum tozu 38,0 ± 0,5 mg/g sinapin içermektedir.
Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları, yağsızlaştırılmış tohum unu ile muamele edildiğinde öldürüldü, ancak tedavinin etkinliği bitki türüne bağlı olarak değişti. Sadece DFP-NT, 24 ve 72 saatlik maruz kalma süresinden sonra sivrisinek larvaları için toksik değildi (Tablo 2). Aktif tohum tozunun toksisitesi, artan konsantrasyonla birlikte arttı (Şekil 1A, B). Tohum ununun sivrisinek larvaları üzerindeki toksisitesi, 24 ve 72 saatlik değerlendirmelerde LC50 değerlerinin ölümcül doz oranının %95 güven aralığına göre önemli ölçüde değişti (Tablo 3). 24 saat sonra, Ls tohum ununun toksik etkisi diğer tohum unu uygulamalarından daha fazlaydı ve larvalar üzerinde en yüksek aktivite ve maksimum toksisiteye sahipti (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larvalar, 24 saat sonra DFP'ye karşı IG, Ls ve PG tohum tozu uygulamalarına kıyasla daha az duyarlıydı; LC50 değerleri sırasıyla 0,115, 0,04 ve 0,08 g/120 ml dH2O olup, bu değerler istatistiksel olarak 0,211 g/120 ml dH2O'luk LC50 değerinden daha yüksekti (Tablo 3). DFP, IG, PG ve Ls'nin LC90 değerleri sırasıyla 0,376, 0,275, 0,137 ve 0,074 g/120 ml dH2O idi (Tablo 2). En yüksek DPP konsantrasyonu 0,12 g/120 ml dH2O idi. 24 saatlik değerlendirmeden sonra, ortalama larva ölüm oranı sadece %12 iken, IG ve PG larvalarının ortalama ölüm oranı sırasıyla %51 ve %82'ye ulaştı. 24 saatlik değerlendirme sonrasında, en yüksek konsantrasyondaki Ls tohum unu uygulamasında (0,075 g/120 ml dH2O) ortalama larva ölüm oranı %99 olarak belirlendi (Şekil 1A).
Ölüm eğrileri, Ae. Egyptian larvalarının (3. evre larvalar) tohum unu konsantrasyonuna olan doz yanıtından (Probit) 24 saat (A) ve 72 saat (B) sonraki sürelerde tahmin edilmiştir. Noktalı çizgi, tohum unu uygulamasının LC50 değerini temsil etmektedir. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Isı ile inaktive edilmiş Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
72 saatlik değerlendirmede, DFP, IG ve PG tohum unu için LC50 değerleri sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,051 g/120 ml dH2O olarak belirlendi. Ls tohum ununa maruz kalan larvaların neredeyse tamamı 72 saatlik maruz kalmanın ardından öldü, bu nedenle ölüm verileri Probit analiziyle tutarsızdı. Diğer tohum unlarıyla karşılaştırıldığında, larvalar DFP tohum unu uygulamasına daha az duyarlıydı ve istatistiksel olarak daha yüksek LC50 değerlerine sahipti (Tablo 2 ve 3). 72 saat sonra, DFP, IG ve PG tohum unu uygulamaları için LC50 değerleri sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,05 g/120 ml dH2O olarak tahmin edildi. 72 saatlik değerlendirme sonrasında, DFP, IG ve PG tohum tozlarının LC90 değerleri sırasıyla 0,215, 0,254 ve 0,138 g/120 ml dH2O olarak belirlendi. 72 saatlik değerlendirme sonrasında, 0,12 g/120 ml dH2O'luk maksimum konsantrasyonda DFP, IG ve PG tohum unu uygulamaları için ortalama larva ölüm oranı sırasıyla %58, %66 ve %96 olarak tespit edildi (Şekil 1B). 72 saatlik değerlendirme sonrasında, PG tohum ununun IG ve DFP tohum unundan daha toksik olduğu bulundu.
Sentetik izotiyosiyanatlar, allil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat (4-HBITC), sivrisinek larvalarını etkili bir şekilde öldürebilir. Tedaviden 24 saat sonra, BITC, 5,29 ppm'lik LC50 değeriyle, AITC için 19,35 ppm ve 4-HBITC için 55,41 ppm'ye kıyasla larvalar için daha toksikti (Tablo 4). AITC ve BITC'ye kıyasla, 4-HBITC daha düşük toksisiteye ve daha yüksek bir LC50 değerine sahiptir. En güçlü tohum unu içindeki iki ana izotiyosiyanatın (Ls ve PG) sivrisinek larvaları üzerindeki toksisitesinde önemli farklılıklar vardır. AITC, BITC ve 4-HBITC arasındaki LC50 değerlerinin ölümcül doz oranına dayalı toksisite, LC50 ölümcül doz oranının %95 güven aralığının 1 değerini içermemesi (P = 0,05, Tablo 4) şeklinde istatistiksel bir farklılık göstermiştir. Hem BITC hem de AITC'nin en yüksek konsantrasyonlarının test edilen larvaların %100'ünü öldürdüğü tahmin edilmiştir (Şekil 2).
Ölüm oranları, Ae. 24'ün doz yanıtı (Probit) modelinden tahmin edilmiştir. Tedaviden 24 saat sonra, Mısır larvaları (3. evre larvalar) sentetik izotiyosiyanat konsantrasyonlarına ulaşmıştır. Noktalı çizgi, izotiyosiyanat tedavisi için LC50 değerini temsil etmektedir. Benzil izotiyosiyanat BITC, allil izotiyosiyanat AITC ve 4-HBITC.
Bitkisel biyopestisitlerin sivrisinek vektör kontrolü ajanları olarak kullanımı uzun zamandır incelenmektedir. Birçok bitki, böcek öldürücü aktiviteye sahip doğal kimyasallar üretir37. Bu biyoaktif bileşikler, sivrisinekler de dahil olmak üzere zararlıları kontrol etmede büyük potansiyele sahip sentetik böcek ilaçlarına cazip bir alternatif sunmaktadır.
Hardal bitkileri, baharat ve yağ kaynağı olarak kullanılan tohumları için bir ürün olarak yetiştirilir. Hardal yağı tohumlardan çıkarıldığında veya hardal biyoyakıt olarak kullanılmak üzere çıkarıldığında, yan ürün olarak yağsızlaştırılmış tohum unu elde edilir. Bu tohum unu, doğal biyokimyasal bileşenlerinin ve hidrolitik enzimlerinin çoğunu korur. Bu tohum ununun toksisitesi, izotiyosiyanatların üretimine atfedilir55,60,61. İzotiyosiyanatlar, tohum ununun hidrasyonu sırasında mirosinaz enzimi tarafından glukosinolatların hidroliziyle oluşur38,55,70 ve fungisidal, bakterisidal, nematit öldürücü ve insektisit etkilerinin yanı sıra kimyasal duyusal etkiler ve kemoterapötik özellikler de dahil olmak üzere diğer özelliklere sahip olduğu bilinmektedir61,62,70. Birçok çalışma, hardal bitkilerinin ve tohum ununun toprak ve depolanmış gıda zararlılarına karşı etkili bir şekilde fumigant görevi gördüğünü göstermiştir57,59,71,72. Bu çalışmada, dört tohumlu unun ve üç biyoaktif ürünü olan AITC, BITC ve 4-HBITC'nin Aedes sivrisinek larvalarına (Aedes aegypti) olan toksisitesini değerlendirdik. Tohum ununun doğrudan sivrisinek larvaları içeren suya eklenmesinin, sivrisinek larvaları için toksik olan izotiyosiyanatları üreten enzimatik süreçleri aktive etmesi beklenmektedir. Bu biyotransformasyon, kısmen tohum ununun gözlemlenen larvisidal aktivitesi ve cüce hardal tohumu ununun kullanımdan önce ısı işlemine tabi tutulmasıyla insektisit aktivitesinin kaybı ile gösterilmiştir. Isı işleminin, glukosinolatları aktive eden hidrolitik enzimleri yok ederek biyoaktif izotiyosiyanatların oluşumunu engellemesi beklenmektedir. Bu, lahana tohumu tozunun sivrisineklere karşı insektisit özelliklerini su ortamında doğrulayan ilk çalışmadır.
Test edilen tohum tozları arasında, su teresi tohumu tozu (Ls) en toksik olanıydı ve Aedes albopictus'ta yüksek ölüm oranına neden oldu. Aedes aegypti larvaları 24 saat boyunca sürekli olarak işlendi. Geri kalan üç tohum tozu (PG, IG ve DFP) daha yavaş aktivite gösterdi ve 72 saatlik sürekli işlemden sonra bile önemli ölüm oranına neden oldu. Sadece Ls tohum unu önemli miktarda glukosinolat içerirken, PG ve DFP mirosinaz, IG ise ana glukosinolat olarak glukosinolat içeriyordu (Tablo 1). Glukotropaeolin BITC'ye, sinalbin ise 4-HBITC61,62'ye hidrolize olur. Biyoanaliz sonuçlarımız, hem Ls tohum ununun hem de sentetik BITC'nin sivrisinek larvaları için oldukça toksik olduğunu göstermektedir. PG ve DFP tohum ununun ana bileşeni, AITC'ye hidrolize olan mirosinaz glukosinolattır. AITC, 19,35 ppm'lik LC50 değeriyle sivrisinek larvalarını öldürmede etkilidir. AITC ve BITC ile karşılaştırıldığında, 4-HBITC izotiyosiyanat larvalar için en az toksik olanıdır. AITC, BITC'den daha az toksik olmasına rağmen, LC50 değerleri sivrisinek larvaları üzerinde test edilen birçok uçucu yağdan daha düşüktür32,73,74,75.
Sivrisinek larvalarına karşı kullanılan turpgiller tohumu tozumuz, HPLC ile belirlendiği üzere toplam glukosinolatların %98-99'undan fazlasını oluşturan tek bir ana glukosinolat içermektedir. Diğer glukosinolatların eser miktarları tespit edildi, ancak seviyeleri toplam glukosinolatların %0,3'ünden azdı. Su teresi (L. sativum) tohumu tozu ikincil glukosinolatlar (sinigrin) içerir, ancak bunların oranı toplam glukosinolatların %1'idir ve içerikleri yine de önemsizdir (yaklaşık 0,4 mg/g tohum tozu). PG ve DFP aynı ana glukosinolatı (mirosin) içermesine rağmen, tohum yemlerinin larva öldürücü aktivitesi, LC50 değerleri nedeniyle önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Külleme hastalığına karşı toksisitesi değişmektedir. Aedes aegypti larvalarının ortaya çıkması, iki tohum yemi arasındaki mirosinaz aktivitesi veya stabilitesindeki farklılıklardan kaynaklanabilir. Mirosinaz aktivitesi, Brassicaceae bitkilerinde izotiyosiyanatlar gibi hidroliz ürünlerinin biyoyararlanımında önemli bir rol oynar.76 Pocock ve ark.77 ile Wilkinson ve ark.78 tarafından yapılan önceki raporlar, mirosinaz aktivitesi ve stabilitesindeki değişikliklerin genetik ve çevresel faktörlerle de ilişkili olabileceğini göstermiştir.
Beklenen biyoaktif izotiyosiyanat içeriği, ilgili kimyasal uygulamalarla karşılaştırma için her bir tohum unu için 24 ve 72 saatlik LC50 değerlerine (Tablo 5) göre hesaplandı. 24 saat sonra, tohum unundaki izotiyosiyanatlar saf bileşiklerden daha toksikti. İzotiyosiyanat tohum uygulamalarının milyonda bir (ppm) cinsinden hesaplanan LC50 değerleri, BITC, AITC ve 4-HBITC uygulamalarının LC50 değerlerinden daha düşüktü. Larvaların tohum unu peletlerini tükettiğini gözlemledik (Şekil 3A). Sonuç olarak, larvalar tohum unu peletlerini yutarak toksik izotiyosiyanatlara daha yoğun maruz kalabilirler. Bu durum, 24 saatlik maruz kalma süresinde IG ve PG tohum unu uygulamalarında en belirgindi; burada LC50 konsantrasyonları sırasıyla saf AITC ve 4-HBITC uygulamalarına göre %75 ve %72 daha düşüktü. Ls ve DFP uygulamaları, saf izotiyosiyanata göre daha toksikti ve LC50 değerleri sırasıyla %24 ve %41 daha düşüktü. Kontrol uygulamasındaki larvalar başarılı bir şekilde pupa evresine geçti (Şekil 3B), oysa tohum unu uygulamasındaki larvaların çoğu pupa evresine geçmedi ve larva gelişimi önemli ölçüde gecikti (Şekil 3B,D). Spodoptera alitura'da izotiyosiyanatlar büyüme geriliği ve gelişim gecikmesi ile ilişkilidir79.
Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları 24-72 saat boyunca sürekli olarak Brassica tohum tozuna maruz bırakıldı. (A) Ağız kısımlarında tohum unu parçacıkları bulunan ölü larvalar (daire içine alınmış); (B) Kontrol uygulaması (tohum unu eklenmemiş dH20), larvaların normal şekilde büyüdüğünü ve 72 saat sonra pupalaşmaya başladığını göstermektedir (C, D) Tohum unu ile muamele edilen larvalar; tohum unu, gelişimde farklılıklar gösterdi ve pupalaşmadı.
İzotiyosiyanatların sivrisinek larvaları üzerindeki toksik etkilerinin mekanizmasını incelemedik. Bununla birlikte, kırmızı ateş karıncaları (Solenopsis invicta) üzerinde yapılan önceki çalışmalar, glutatyon S-transferaz (GST) ve esteraz (EST) inhibisyonunun izotiyosiyanat biyolojik aktivitesinin ana mekanizması olduğunu ve AITC'nin, düşük aktivitede bile, düşük konsantrasyonlarda kırmızı ithal ateş karıncalarında GST aktivitesini inhibe edebildiğini göstermiştir. Doz 0,5 µg/ml80'dir. Buna karşılık, AITC, yetişkin mısır böceğinde (Sitophilus zeamais) asetilkolinesterazı inhibe eder81. İzotiyosiyanat aktivitesinin sivrisinek larvalarındaki mekanizmasını aydınlatmak için benzer çalışmalar yapılmalıdır.
Hardal tohumu ununun sivrisinek larvalarını kontrol etme mekanizması olarak bitki glukosinolatlarının hidroliziyle reaktif izotiyosiyanatların oluştuğu önerisini desteklemek için ısı ile etkisizleştirilmiş DFP işlemi kullandık. DFP-HT tohum unu, test edilen uygulama oranlarında toksik değildi. Lafarga vd. 82, glukosinolatların yüksek sıcaklıklarda bozunmaya duyarlı olduğunu bildirmiştir. Isı işleminin ayrıca tohum unundaki mirosinaz enzimini de denatüre etmesi ve glukosinolatların hidroliziyle reaktif izotiyosiyanatların oluşmasını engellemesi beklenmektedir. Bu, Okunade vd. 75 tarafından da doğrulanmıştır; mirosinazın sıcaklığa duyarlı olduğunu ve hardal, kara hardal ve kan kökü tohumları 80°C'nin üzerindeki sıcaklıklara maruz kaldığında mirosinaz aktivitesinin tamamen etkisiz hale geldiğini göstermişlerdir. Bu mekanizmalar, ısı ile işlenmiş DFP tohum ununun insektisit aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Bu nedenle, hardal tohumu unu ve üç ana izotiyosiyanatı sivrisinek larvaları için zehirlidir. Tohum unu ve kimyasal işlemler arasındaki bu farklılıklar göz önüne alındığında, tohum ununun kullanımı sivrisinek kontrolünde etkili bir yöntem olabilir. Tohum tozlarının kullanımının etkinliğini ve stabilitesini artırmak için uygun formülasyonların ve etkili dağıtım sistemlerinin belirlenmesine ihtiyaç vardır. Sonuçlarımız, hardal tohumu ununun sentetik pestisitlere alternatif olarak potansiyel kullanımını göstermektedir. Bu teknoloji, sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi bir araç haline gelebilir. Sivrisinek larvaları su ortamlarında geliştiği ve tohum unu glukosinolatları hidrasyon üzerine enzimatik olarak aktif izotiyosiyanatlara dönüştürüldüğü için, sivrisinek bulaşmış sularda hardal tohumu ununun kullanımı önemli bir kontrol potansiyeli sunmaktadır. İzotiyosiyanatların larvisidal aktivitesi değişmekle birlikte (BITC > AITC > 4-HBITC), tohum ununun birden fazla glukosinolatla birleştirilmesinin toksisiteyi sinerjik olarak artırıp artırmadığını belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu çalışma, yağdan arındırılmış turpgiller tohumu küspesi ve üç biyoaktif izotiyosiyanatın sivrisinekler üzerindeki insektisit etkilerini gösteren ilk çalışmadır. Bu çalışmanın sonuçları, tohumlardan yağ ekstraksiyonunun bir yan ürünü olan yağdan arındırılmış lahana tohumu küspesinin, sivrisinek kontrolü için umut vadeden bir larvasit ajanı olarak kullanılabileceğini göstererek yeni bir çığır açmaktadır. Bu bilgi, bitki biyolojik kontrol ajanlarının keşfedilmesine ve bunların ucuz, pratik ve çevre dostu biyopestisitler olarak geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Bu çalışma için oluşturulan veri setleri ve elde edilen analizler, makul bir talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Çalışmanın sonunda, çalışmada kullanılan tüm materyaller (böcekler ve tohum unu) imha edilmiştir.
Yayın tarihi: 29 Temmuz 2024