Etkili bir şekildesivrisinekleri kontrol etmekTaşıdıkları hastalıkların görülme sıklığını azaltmak için kimyasal pestisitlere stratejik, sürdürülebilir ve çevre dostu alternatiflere ihtiyaç duyulmaktadır. Mısır Aedes (L., 1762) kontrolünde kullanılmak üzere, biyolojik olarak inaktif glukozinolatların enzimatik hidrolizi ile üretilen bitki kaynaklı izotiyosiyanat kaynağı olarak belirli Brassicaceae (Brassica familyası) tohum unlarını değerlendirdik. Beş yağsız tohum unu (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ve Thlaspi arvense – üç ana termal inaktivasyon ve enzimatik bozunma türü Kimyasal ürünler Allil izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilisotiyosiyanatın Aedes aegypti larvalarına 24 saatlik maruziyette toksisitesini (LC50) belirlemek için = 0,04 g/120 ml dH2O). Hardal, beyaz hardal ve atkuyruğu için LC50 değerleri. Tohum unu, allil izotiyosiyanat (LC50 = 19,35 ppm) ve 4.-Hidroksibenzilizotiyosiyanat (LC50 = 55,41 ppm) ile karşılaştırıldığında sırasıyla 0,05, 0,08 ve 0,05 idi. 4.-Hidroksibenzilizotiyosiyanat (LC50 = 55,41 ppm), sırasıyla 0,1 g/120 ml dH2O'dan işlemden 24 saat sonra larvalar için daha toksikti. Bu sonuçlar yonca tohumu unu üretimiyle tutarlıdır. Benzil esterlerin daha yüksek verimliliği hesaplanan LC50 değerlerine karşılık gelmektedir. Tohum unu kullanımı, sivrisinek kontrolünde etkili bir yöntem sağlayabilir. Turpgiller tohumu tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliği ve turpgiller tohumu tozundaki doğal bileşiklerin sivrisinek kontrolü için nasıl umut verici çevre dostu bir larvisit olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.
Aedes sivrisineklerinin neden olduğu vektör kaynaklı hastalıklar önemli bir küresel halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Sivrisinek kaynaklı hastalıkların görülme sıklığı coğrafi olarak yayılmakta1,2,3 ve yeniden ortaya çıkarak ciddi hastalık salgınlarına yol açmaktadır4,5,6,7. Hastalıkların insanlar ve hayvanlar arasında yayılması (örneğin, chikungunya, dang humması, Rift Vadisi ateşi, sarı humma ve Zika virüsü) eşi benzeri görülmemiş düzeydedir. Tek başına dang humması tropik bölgelerde yaklaşık 3,6 milyar insanı enfeksiyon riski altına sokmaktadır ve her yıl tahmini 390 milyon enfeksiyon meydana gelmekte ve yılda 6.100-24.300 ölüme neden olmaktadır8. Zika virüsünün Güney Amerika'da yeniden ortaya çıkması ve salgını, enfekte kadınların doğurduğu çocuklarda beyin hasarına neden olması nedeniyle dünya çapında dikkat çekmiştir2. Kremer ve ark.3 Aedes sivrisineklerinin coğrafi yayılımının genişlemeye devam edeceğini ve 2050 yılına kadar dünya nüfusunun yarısının sivrisinek kaynaklı arbovirüsler tarafından enfeksiyon riski altında olacağını öngörmektedir.
Son zamanlarda geliştirilen dang humması ve sarı humma aşıları haricinde, sivrisinek kaynaklı hastalıkların çoğuna karşı aşı henüz geliştirilmemiştir9,10,11. Aşılar hâlâ sınırlı miktarlarda mevcuttur ve yalnızca klinik deneylerde kullanılmaktadır. Sentetik böcek öldürücüler kullanılarak sivrisinek vektörlerinin kontrolü, sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasını kontrol altına almak için temel bir strateji olmuştur12,13. Sentetik pestisitler sivrisinekleri öldürmede etkili olsa da, sentetik pestisitlerin sürekli kullanımı hedef dışı organizmaları olumsuz etkilemekte ve çevreyi kirletmektedir14,15,16. Daha da endişe verici olanı, sivrisineklerin kimyasal böcek ilaçlarına karşı direncinin artmasıdır17,18,19. Pestisitlerle ilişkili bu sorunlar, hastalık vektörlerini kontrol altına almak için etkili ve çevre dostu alternatifler arayışını hızlandırmıştır.
Çeşitli bitkiler zararlı kontrolü için fitopestisit kaynağı olarak geliştirilmiştir20,21. Bitkisel maddeler genellikle biyolojik olarak parçalanabilir oldukları ve memeliler, balıklar ve amfibiler gibi hedef dışı organizmalar için düşük veya ihmal edilebilir toksisiteye sahip oldukları için çevre dostudur20,22. Bitkisel preparatların, sivrisineklerin farklı yaşam evrelerini etkili bir şekilde kontrol etmek için farklı etki mekanizmalarına sahip çeşitli biyoaktif bileşikler ürettiği bilinmektedir23,24,25,26. Esansiyel yağlar ve diğer aktif bitki bileşenleri gibi bitki kaynaklı bileşikler dikkat çekmiş ve sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi araçların önünü açmıştır. Esansiyel yağlar, monoterpenler ve seskiterpenler kovucu, besleyici caydırıcı ve ovisitler olarak etki eder27,28,29,30,31,32,33. Birçok bitkisel yağ sivrisinek larvalarının, pupalarının ve yetişkinlerinin ölümüne neden olur34,35,36 ve böceklerin sinir, solunum, endokrin ve diğer önemli sistemlerini etkiler37.
Son çalışmalar, hardal bitkilerinin ve tohumlarının biyoaktif bileşik kaynağı olarak potansiyel kullanımına ışık tutmuştur. Hardal tohumu unu, biyofümigant38,39,40,41 olarak test edilmiş ve yabancı ot baskılaması42,43,44 ve toprak kaynaklı bitki patojenlerinin kontrolü45,46,47,48,49,50, bitki beslenmesi için toprak düzenleyici olarak kullanılmıştır. Nematodlar 41,51, 52, 53, 54 ve zararlılar 55, 56, 57, 58, 59, 60. Bu tohum tozlarının fungisit aktivitesi, izotiyosiyanatlar adı verilen bitki koruyucu bileşiklere atfedilmektedir38,42,60. Bitkilerde, bu koruyucu bileşikler bitki hücrelerinde biyoaktif olmayan glukozinolatlar formunda depolanır. Ancak bitkiler böcek beslenmesi veya patojen enfeksiyonu nedeniyle zarar gördüğünde, glukozinolatlar mirosinaz tarafından biyoaktif izotiyosiyanatlara hidrolize edilir55,61. İzotiyosiyanatlar, geniş spektrumlu antimikrobiyal ve böcek öldürücü aktiviteye sahip olduğu bilinen uçucu bileşiklerdir ve yapıları, biyolojik aktiviteleri ve içerikleri Brassicaceae türleri arasında büyük ölçüde farklılık gösterir42,59,62,63.
Hardal tohumu unundan elde edilen izotiyosiyanatların insektisit aktivitesi olduğu bilinmesine rağmen, tıbbi açıdan önemli eklembacaklı vektörlere karşı biyolojik aktiviteye dair veriler eksiktir. Çalışmamızda, yağı alınmış dört tohum tozunun Aedes sivrisineklerine karşı larvisit aktivitesi incelenmiştir. Aedes aegypti larvaları. Çalışmanın amacı, sivrisinek kontrolünde çevre dostu biyopestisit olarak potansiyel kullanımlarını değerlendirmekti. Tohum ununun üç ana kimyasal bileşeni olan alil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilisotiyosiyanat (4-HBITC), bu kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvaları üzerindeki biyolojik aktivitesini test etmek için de test edilmiştir. Bu, dört lahana tohumu tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliğini değerlendiren ilk rapordur.
Aedes aegypti'nin (Rockefeller suşu) laboratuvar kolonileri 26°C, %70 bağıl nem (RH) ve 10:14 saat (S:G fotoperiyodu) koşullarında muhafaza edildi. Çiftleşmiş dişiler plastik kafeslerde (yükseklik 11 cm ve çap 9,5 cm) barındırıldı ve sitratlı sığır kanı kullanılarak bir şişe besleme sistemiyle (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, ABD) beslendi. Kan beslemesi her zamanki gibi, sıcaklık kontrolü 37°C olan bir sirkülasyonlu su banyosu tüpüne (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, ABD) bağlı bir membranlı çok camlı besleyici (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir cam besleme haznesinin (alan 154 mm2) altına bir Parafilm M filmi gerin. Daha sonra her bir besleyici, çiftleşen dişinin bulunduğu kafesi kaplayan üst ızgaraya yerleştirildi. Yaklaşık 350-400 μl sığır kanı, bir Pasteur pipeti (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak cam besleme hunisine eklendi ve yetişkin solucanların en az bir saat boyunca süzülmesine izin verildi. Gebe dişilere daha sonra %10'luk bir sukroz çözeltisi verildi ve yumurtalarını ayrı ayrı ultra şeffaf sufle kaplarına (1,25 fl oz boyutu, Dart Container Corp., Mason, MI, ABD) yerleştirilmiş nemli filtre kağıdına bırakmalarına izin verildi. Yumurtaları suyla dolu bir kafese koyun. Yumurtaları içeren filtre kağıdını kapalı bir torbaya (SC Johnsons, Racine, WI) yerleştirin ve 26°C'de saklayın. Yumurtalar çatladı ve yaklaşık 200-250 larva, tavşan yemi (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ABD) ve karaciğer tozu (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ABD) karışımı içeren plastik tepsilerde büyütüldü. ve balık filetosu (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Almanya) 2:1:1 oranında kullanılmıştır. Biyolojik denemelerimizde geç üçüncü evre larvaları kullanılmıştır.
Bu çalışmada kullanılan bitki tohumu materyali aşağıdaki ticari ve hükümet kaynaklarından elde edilmiştir: Brassica juncea (kahverengi hardal-Pacific Gold) ve Brassica juncea (beyaz hardal-Ida Gold), ABD, Washington Eyaleti, Pasifik Kuzeybatı Çiftçiler Kooperatifi'nden; (Garden Cress), ABD, Peoria, IL, Kelly Seed and Hardware Co.'dan ve Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth), ABD, Peoria, IL, USDA-ARS'den; Çalışmada kullanılan tohumların hiçbiri pestisitlerle işlenmemiştir. Tüm tohum materyali, yerel ve ulusal düzenlemelere ve ilgili tüm yerel, eyalet ve ulusal düzenlemelere uygun olarak bu çalışmada işlenmiş ve kullanılmıştır. Bu çalışmada transgenik bitki çeşitleri incelenmemiştir.
Brassica juncea (PG), Yonca (Ls), Beyaz hardal (IG), Thlaspi arvense (DFP) tohumları, 0,75 mm gözenekli ve paslanmaz çelik rotorlu, 12 dişli, 10.000 rpm'lik bir Retsch ZM200 ultra santrifüj değirmeni (Retsch, Haan, Almanya) kullanılarak ince bir toz haline getirildi (Tablo 1). Öğütülmüş tohum tozu bir kağıt yüksük üzerine aktarıldı ve 24 saat boyunca bir Soxhlet cihazında heksanla yağdan arındırıldı. Yağdan arındırılmış bir hardal alt örneği, mirosinazı denatüre etmek ve glukozinolatların hidrolizini önleyerek biyolojik olarak aktif izotiyosiyanatlar oluşturmasını önlemek için 100 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutuldu. Isıl işlem görmüş atkuyruğu tohumu tozu (DFP-HT), mirosinazı denatüre ederek negatif kontrol olarak kullanıldı.
Yağdan arındırılmış tohum küspesinin glukozinolat içeriği, daha önce yayınlanmış bir protokole 64 göre yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak üç kez belirlendi. Kısaca, 250 mg yağdan arındırılmış tohum tozu örneğine 3 mL metanol eklendi. Her örnek 30 dakika su banyosunda sonikasyona tabi tutuldu ve 16 saat boyunca 23°C'de karanlıkta bırakıldı. Daha sonra organik katmanın 1 mL'lik bir kısmı 0,45 μm'lik bir filtreden otomatik örnekleyiciye filtrelendi. Bir Shimadzu HPLC sistemi (iki LC 20AD pompası; SIL 20A otomatik örnekleyici; DGU 20As gaz giderici; 237 nm'de izleme için SPD-20A UV-VIS dedektörü; ve CBM-20A iletişim veri yolu modülü) çalıştırılarak, tohum küspesinin glukozinolat içeriği üç kez belirlendi. Shimadzu LC Solution yazılım sürümü 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, ABD) kullanılarak. Kolon, C18 Inertsil ters faz kolonuydu (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ABD). Başlangıç hareketli faz koşulları, 1 mL/dak akış hızıyla %12 metanol/%88 0,01 M tetrabütilamonyum hidroksit (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) olarak ayarlandı. 15 μl numune enjeksiyonundan sonra, başlangıç koşulları 20 dakika boyunca korundu ve ardından çözücü oranı %100 metanole ayarlandı; toplam numune analiz süresi 65 dakikaydı. Yağdan arındırılmış tohum unu kükürt içeriğini tahmin etmek için taze hazırlanmış sinapin, glukozinolat ve mirosin standartlarının (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) seri seyreltilmesiyle bir standart eğri (nM/mAb bazlı) oluşturuldu. glukozinolatlar. Numunelerdeki glukozinolat konsantrasyonları, aynı kolonla donatılmış ve daha önce açıklanan bir yöntem kullanılarak OpenLAB CDS ChemStation sürümü (C.01.07 SR2 [255]) kullanılarak bir Agilent 1100 HPLC'de (Agilent, Santa Clara, CA, ABD) test edildi. Glukozinolat konsantrasyonları belirlendi; HPLC sistemleri arasında karşılaştırılabilir hale getirildi.
Alil izotiyosiyanat (%94, kararlı) ve benzil izotiyosiyanat (%98), Fisher Scientific'ten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) satın alındı. 4-Hidroksibenzilisotiyosiyanat, ChemCruz'dan (Santa Cruz Biotechnology, CA, ABD) satın alındı. Mirosinaz tarafından enzimatik olarak hidrolize edildiğinde, glukosinolatlar, glukosinolatlar ve glukosinolatlar sırasıyla alil izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilisotiyosiyanatı oluşturur.
Laboratuvar biyolojik analizleri Muturi ve ark.'nın 32 modifikasyonlu yöntemine göre gerçekleştirildi. Çalışmada beş düşük yağlı tohum yemi kullanıldı: DFP, DFP-HT, IG, PG ve Ls. Yirmi larva, 120 mL deiyonize su (dH2O) içeren 400 mL tek kullanımlık üç yollu bir behere (VWR International, LLC, Radnor, PA, ABD) yerleştirildi. Sivrisinek larva toksisitesi için yedi tohum unu konsantrasyonu test edildi: DFP tohum unu, DFP-HT, IG ve PG için 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 ve 0,12 g tohum unu/120 ml dH2O. Ön biyolojik analizler, yağsızlaştırılmış Ls tohum ununun test edilen diğer dört tohum unundan daha toksik olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Ls tohum unu için yedi uygulama konsantrasyonunu şu konsantrasyonlara ayarladık: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 ve 0,075 g/120 mL dH2O.
Deney koşulları altında normal böcek ölüm oranını değerlendirmek için işlem görmemiş bir kontrol grubu (dH2O, tohum unu takviyesi yok) dahil edildi. Her tohum unu için toksikolojik biyolojik deneyler, toplam 108 şişe için üç tekrarlı üç eğimli beher (beher başına 20 geç üçüncü dönem larva) içeriyordu. İşlem görmüş kaplar oda sıcaklığında (20-21 °C) saklandı ve larva ölümleri, işlem konsantrasyonlarına sürekli maruz kalmanın 24 ve 72 saati boyunca kaydedildi. Sivrisineğin vücudu ve uzantıları ince paslanmaz çelik bir spatula ile delindiğinde veya dokunulduğunda hareket etmiyorsa, sivrisinek larvaları ölü kabul edilir. Ölü larvalar genellikle kabın dibinde veya su yüzeyinde dorsal veya ventral pozisyonda hareketsiz kalır. Deney, her bir işlem konsantrasyonuna maruz bırakılan toplam 180 larva için farklı larva grupları kullanılarak farklı günlerde üç kez tekrarlandı.
AITC, BITC ve 4-HBITC'in sivrisinek larvalarına olan toksisitesi aynı biyolojik deney prosedürü kullanılarak ancak farklı işlemlerle değerlendirildi. Her kimyasal için 100.000 ppm'lik stok çözeltileri hazırlayın; bunun için 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde 900 µL mutlak etanole 100 µL kimyasal ekleyin ve iyice karışması için 30 saniye çalkalayın. İşlem konsantrasyonları, BITC'nin AITC ve 4-HBITC'den çok daha toksik olduğunu bulan ön biyolojik deneylerimize dayanarak belirlendi. Toksisiteyi belirlemek için 5 BITC konsantrasyonu (1, 3, 6, 9 ve 12 ppm), 7 AITC konsantrasyonu (5, 10, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) ve 6 4-HBITC konsantrasyonu (15, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) kullanıldı. 30, 45, 60, 75 ve 90 ppm). Kontrol uygulamasına, kimyasal uygulamanın maksimum hacmine eşdeğer olan 108 μL mutlak etanol enjekte edildi. Biyolojik analizler, uygulama konsantrasyonu başına toplam 180 larva eklenerek yukarıdaki gibi tekrarlandı. 24 saatlik sürekli maruziyetin ardından her AITC, BITC ve 4-HBITC konsantrasyonu için larva ölüm oranı kaydedildi.
65 dozla ilişkili ölüm verisinin probit analizi, %50 öldürücü konsantrasyon (LC50), %90 öldürücü konsantrasyon (LC90), eğim, öldürücü doz katsayısı ve %95 öldürücü konsantrasyonu hesaplamak için Polo yazılımı (Polo Plus, LeOra Yazılımı, sürüm 1.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Log-dönüştürülmüş konsantrasyon ve doz-ölüm eğrileri için öldürücü doz oranlarına ilişkin güven aralıklarına dayanmaktadır. Ölüm verileri, her bir uygulama konsantrasyonuna maruz bırakılan 180 larvanın birleştirilmiş tekrar verilerine dayanmaktadır. Olasılıksal analizler, her bir tohum unu ve her bir kimyasal bileşen için ayrı ayrı gerçekleştirildi. Öldürücü doz oranının %95 güven aralığına dayanarak, tohum unu ve kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvaları için toksisitesinin önemli ölçüde farklı olduğu düşünüldü, bu nedenle 1 değerini içeren bir güven aralığı önemli ölçüde farklı değildi, P = 0,0566.
Yağsız tohum unları DFP, IG, PG ve Ls'deki başlıca glukozinolatların belirlenmesine yönelik HPLC sonuçları Tablo 1'de listelenmiştir. Test edilen tohum unlarındaki başlıca glukozinolatlar, her ikisi de mirosinaz glukozinolatları içeren DFP ve PG hariç, çeşitlilik göstermiştir. PG'deki mirosin içeriği, DFP'dekinden daha yüksek olup sırasıyla 33,3 ± 1,5 ve 26,5 ± 0,9 mg/g'dır. Ls tohum tozu 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikon içerirken, IG tohum tozu 38,0 ± 0,5 mg/g sinapin içermektedir.
Ae. Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları, yağsız tohum unu ile muamele edildiğinde öldürüldü, ancak muamelenin etkinliği bitki türlerine bağlı olarak değişti. Sadece DFP-NT, 24 ve 72 saatlik maruziyetten sonra sivrisinek larvaları için toksik değildi (Tablo 2). Aktif tohum tozunun toksisitesi artan konsantrasyonla arttı (Şekil 1A, B). Tohum ununun sivrisinek larvaları için toksisitesi, 24 ve 72 saatlik değerlendirmelerde LC50 değerlerinin letal doz oranının %95 CI'sına göre önemli ölçüde değişti (Tablo 3). 24 saat sonra, Ls tohum unu toksik etkisi diğer tohum unu muamelelerinden daha büyüktü, en yüksek aktivite ve larvalar için maksimum toksisite (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O) idi. Larvalar, IG, Ls ve PG tohum tozu uygulamalarına kıyasla 24 saatte DFP'ye daha az duyarlıydı, LC50 değerleri sırasıyla 0,115, 0,04 ve 0,08 g/120 ml dH2O idi ve bu değerler istatistiksel olarak LC50 değerinden yüksekti. 0,211 g/120 ml dH2O (Tablo 3). DFP, IG, PG ve Ls'nin LC90 değerleri ise sırasıyla 0,376, 0,275, 0,137 ve 0,074 g/120 ml dH2O idi (Tablo 2). En yüksek DPP konsantrasyonu 0,12 g/120 ml dH2O idi. 24 saatlik değerlendirmeden sonra ortalama larva ölüm oranı sadece %12 iken, IG ve PG larvalarının ortalama ölüm oranı sırasıyla %51 ve %82'ye ulaştı. 24 saatlik değerlendirmeden sonra, en yüksek Ls tohum unu konsantrasyonunda (0,075 g/120 ml dH2O) ortalama larva ölüm oranı %99 olarak bulundu (Şekil 1A).
Ölüm eğrileri, Ae. Mısır larvalarının (3. evre larvaları) doz yanıtından (Probit) 24 saat (A) ve 72 saat (B) sonra tohum unu konsantrasyonuna göre tahmin edilmiştir. Noktalı çizgi, tohum unu uygulamasının LC50 değerini temsil etmektedir. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Isı ile inaktive edilmiş Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
72 saatlik değerlendirmede, DFP, IG ve PG tohum unu için LC50 değerleri sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,051 g/120 ml dH2O olarak bulundu. Ls tohum unu uygulanan larvaların neredeyse tamamı 72 saatlik maruziyetten sonra öldüğünden, ölüm verileri Probit analiziyle tutarsızdı. Diğer tohum unu uygulanan larvalara kıyasla, larvalar DFP tohum unu uygulamasına daha az duyarlıydı ve istatistiksel olarak daha yüksek LC50 değerlerine sahipti (Tablo 2 ve 3). 72 saat sonra, DFP, IG ve PG tohum unu uygulamaları için LC50 değerlerinin sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,05 g/120 ml dH2O olduğu tahmin edildi. 72 saatlik değerlendirmenin ardından, DFP, IG ve PG tohum tozlarının LC90 değerleri sırasıyla 0,215, 0,254 ve 0,138 g/120 ml dH2O olarak bulundu. 72 saatlik değerlendirmenin ardından, maksimum 0,12 g/120 ml dH2O konsantrasyonunda DFP, IG ve PG tohum unu uygulamalarında ortalama larva ölüm oranları sırasıyla %58, %66 ve %96 olarak bulundu (Şekil 1B). 72 saatlik değerlendirmenin ardından, PG tohum unu, IG ve DFP tohum unu'ndan daha toksik bulundu.
Sentetik izotiyosiyanatlar, allil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat (4-HBITC), sivrisinek larvalarını etkili bir şekilde öldürebilir. İşlemden 24 saat sonra, BITC larvalar için daha toksikti ve LC50 değeri AITC için 19,35 ppm ve 4-HBITC için 55,41 ppm iken, 5,29 ppm idi (Tablo 4). AITC ve BITC ile karşılaştırıldığında, 4-HBITC daha düşük toksisiteye ve daha yüksek LC50 değerine sahiptir. En güçlü tohum küspesindeki iki ana izotiyosiyanatın (Ls ve PG) sivrisinek larva toksisitesinde önemli farklılıklar vardır. AITC, BITC ve 4-HBITC arasındaki LC50 değerlerinin letal doz oranına dayalı toksisite, LC50 letal doz oranının %95 CI'sinin 1 değerini içermemesi gibi istatistiksel bir fark göstermiştir (P = 0,05, Tablo 4). Hem BITC hem de AITC'nin en yüksek konsantrasyonlarının, test edilen larvaların %100'ünü öldürdüğü tahmin edilmektedir (Şekil 2).
Ölüm eğrileri, Ae.'nin doz yanıtından (Probit) tahmin edilmiştir. Tedaviden 24 saat sonra, Mısır larvaları (3. evre larvalar) sentetik izotiyosiyanat konsantrasyonlarına ulaşmıştır. Noktalı çizgi, izotiyosiyanat tedavisi için LC50 değerini temsil etmektedir. Benzil izotiyosiyanat BITC, alil izotiyosiyanat AITC ve 4-HBITC.
Bitkisel biyopestisitlerin sivrisinek vektör kontrol ajanı olarak kullanımı uzun zamandır araştırılmaktadır. Birçok bitki, böcek öldürücü etkiye sahip doğal kimyasallar üretir37. Biyoaktif bileşikleri, sivrisinekler de dahil olmak üzere zararlıların kontrolünde büyük potansiyele sahip, sentetik böcek ilaçlarına cazip bir alternatif sunar.
Hardal bitkileri, tohumları için bir ürün olarak yetiştirilir, baharat ve yağ kaynağı olarak kullanılır. Hardal yağı tohumlardan çıkarıldığında veya biyoyakıt olarak kullanılmak üzere çıkarıldığında, 69 yan ürün yağsız tohum unu olur. Bu tohum unu, doğal biyokimyasal bileşenlerinin ve hidrolitik enzimlerinin çoğunu korur. Bu tohum unu toksisitesi, izotiyosiyanat üretimine atfedilir55,60,61. İzotiyosiyanatlar, tohum unu hidrasyonu sırasında mirosinaz enzimi tarafından glukozinolatların hidrolizi ile oluşur38,55,70 ve fungisidal, bakterisidal, nematisidal ve insektisidal etkilerinin yanı sıra kimyasal duyusal etkiler ve kemoterapötik özellikler de dahil olmak üzere diğer özelliklere sahip oldukları bilinmektedir61,62,70. Çeşitli çalışmalar, hardal bitkilerinin ve tohum unu'nun toprak ve depolanmış gıda zararlılarına karşı etkili bir şekilde fumigant görevi gördüğünü göstermiştir57,59,71,72. Bu çalışmada, dört tohum unu ve üç biyoaktif ürünü olan AITC, BITC ve 4-HBITC'nin Aedes sivrisinek larvaları üzerindeki toksisitesini değerlendirdik. Aedes aegypti. Sivrisinek larvaları içeren suya doğrudan tohum unu eklenmesinin, sivrisinek larvaları için toksik olan izotiyosiyanatlar üreten enzimatik süreçleri aktive etmesi beklenir. Bu biyotransformasyon kısmen, tohum unu'nun gözlenen larvisit aktivitesi ve cüce hardal tohumu unu kullanılmadan önce ısıl işleme tabi tutulduğunda insektisit aktivitesinin kaybı ile gösterilmiştir. Isıl işlemin, glukozinolatları aktive eden hidrolitik enzimleri yok etmesi ve böylece biyoaktif izotiyosiyanatların oluşumunu engellemesi beklenir. Bu, lahana çekirdeği tozunun sucul bir ortamda sivrisineklere karşı insektisit özelliklerini doğrulayan ilk çalışmadır.
Test edilen tohum tozları arasında, su teresi tohumu tozu (Ls) en toksik olanıydı ve Aedes albopictus'ta yüksek oranda ölüme neden oldu. Aedes aegypti larvaları 24 saat boyunca sürekli olarak işlendi. Geriye kalan üç tohum tozu (PG, IG ve DFP) daha yavaş aktiviteye sahipti ve 72 saatlik sürekli işlemden sonra bile önemli oranda ölüme neden oldu. Sadece Ls tohum unu önemli miktarda glukozinolat içeriyordu, oysa PG ve DFP mirosinaz içeriyordu ve IG majör glukozinolat olarak glukozinolat içeriyordu (Tablo 1). Glukotropaeolin BITC'ye hidrolize edilir ve sinalbin 4-HBITC61,62'ye hidrolize edilir. Biyolojik deney sonuçlarımız hem Ls tohum unu hem de sentetik BITC'nin sivrisinek larvaları için oldukça toksik olduğunu göstermektedir. PG ve DFP tohum unu ana bileşeni, AITC'ye hidrolize edilen mirosinaz glukozinolattır. AITC, 19,35 ppm'lik bir LC50 değeriyle sivrisinek larvalarını öldürmede etkilidir. AITC ve BITC ile karşılaştırıldığında, 4-HBITC izotiyosiyanat larvalar için en az toksik olanıdır. AITC, BITC'den daha az toksik olmasına rağmen, LC50 değerleri sivrisinek larvaları üzerinde test edilen birçok uçucu yağdan daha düşüktür32,73,74,75.
Sivrisinek larvalarına karşı kullanılmak üzere hazırladığımız turpgiller tohumu tozumuz, HPLC ile belirlenen toplam glukozinolatların %98-99'undan fazlasını oluşturan bir ana glukozinolat içerir. Diğer glukozinolatların eser miktarları tespit edildi, ancak bunların seviyeleri toplam glukozinolatların %0,3'ünden azdı. Tere (L. sativum) tohumu tozu ikincil glukozinolatlar (sinigrin) içerir, ancak bunların oranı toplam glukozinolatların %1'idir ve içerikleri hala önemsizdir (yaklaşık 0,4 mg/g tohum tozu). PG ve DFP aynı ana glukozinolat (mirosin) içermesine rağmen, tohum öğünlerinin larvisit aktivitesi LC50 değerleri nedeniyle önemli ölçüde farklılık gösterir. Külleme hastalığına karşı toksisitesi değişkendir. Aedes aegypti larvalarının ortaya çıkışı, iki tohum yemi arasındaki mirosinaz aktivitesi veya stabilite farklılıklarından kaynaklanıyor olabilir. Mirosinaz aktivitesi, Brassicaceae bitkilerinde izotiyosiyanatlar gibi hidroliz ürünlerinin biyoyararlanımında önemli bir rol oynar76. Pocock ve ark.77 ve Wilkinson ve ark.78 tarafından yapılan önceki raporlar, mirosinaz aktivitesindeki ve stabilitesindeki değişikliklerin genetik ve çevresel faktörlerle de ilişkili olabileceğini göstermiştir.
Beklenen biyoaktif izotiyosiyanat içeriği, ilgili kimyasal uygulamalarla karşılaştırmak amacıyla her bir tohum küspesinin 24 ve 72 saatlik LC50 değerlerine göre hesaplandı (Tablo 5). 24 saat sonra, tohum küspesindeki izotiyosiyanatlar saf bileşiklerden daha toksikti. Milyonda bir parça (ppm) izotiyosiyanat tohum uygulamalarına göre hesaplanan LC50 değerleri, BITC, AITC ve 4-HBITC uygulamaları için hesaplanan LC50 değerlerinden düşüktü. Larvaların tohum küspesi peletlerini tükettiğini gözlemledik (Şekil 3A). Sonuç olarak, larvalar tohum küspesi peletlerini yutarak toksik izotiyosiyanatlara daha yoğun maruz kalabilirler. Bu durum, 24 saatlik maruziyette IG ve PG tohum küspesi uygulamalarında en belirgindi; bu uygulamalarda LC50 konsantrasyonları sırasıyla saf AITC ve 4-HBITC uygulamalarından %75 ve %72 daha düşüktü. Ls ve DFP uygulamaları, saf izotiyosiyanattan daha toksik olup, LC50 değerleri sırasıyla %24 ve %41 daha düşüktü. Kontrol uygulamasındaki larvalar başarılı bir şekilde pupa olurken (Şekil 3B), tohum unu uygulamasındaki larvaların çoğu pupa olmadı ve larva gelişimi önemli ölçüde gecikti (Şekil 3B,D). Spodopteralitura'da izotiyosiyanatlar, büyüme geriliği ve gelişimsel gecikmeyle ilişkilidir79.
Ae. Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları, 24-72 saat boyunca sürekli olarak Brassica tohum tozuna maruz bırakıldı. (A) Ağız kısımlarında tohum unu parçacıkları bulunan ölü larvalar (daire içine alınmış); (B) Kontrol uygulaması (tohum unu eklenmemiş dH2O), larvaların normal şekilde büyüdüğünü ve 72 saat sonra pupa olmaya başladığını göstermektedir (C, D) Tohum unu ile tedavi edilen larvalar; tohum unu gelişimde farklılıklar göstermiş ve pupa olmamıştır.
İzotiyosiyanatların sivrisinek larvaları üzerindeki toksik etki mekanizmasını incelemedik. Ancak, kırmızı ateş karıncaları (Solenopsis invicta) üzerinde yapılan önceki çalışmalar, glutatyon S-transferaz (GST) ve esteraz (EST) inhibisyonunun izotiyosiyanat biyoaktivitesinin ana mekanizması olduğunu ve AITC'nin, düşük aktivitede bile, GST aktivitesini inhibe edebileceğini göstermiştir. Kırmızı ithal ateş karıncalarında düşük konsantrasyonlarda. Doz 0,5 µg/ml'dir80. Buna karşılık, AITC yetişkin mısır böceklerinde (Sitophilus zeamais) asetilkolinesterazı inhibe eder81. Sivrisinek larvalarındaki izotiyosiyanat aktivitesinin mekanizmasını açıklamak için benzer çalışmalar yapılmalıdır.
Bitkisel glukozinolatların reaktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizinin, hardal tohumu unu ile sivrisinek larvalarının kontrolünde bir mekanizma olarak hizmet ettiği önerisini desteklemek için ısıyla inaktive edilmiş DFP işlemini kullanıyoruz. DFP-HT tohum unu test edilen uygulama oranlarında toksik değildi. Lafarga ve arkadaşları 82 glukozinolatların yüksek sıcaklıklarda bozulmaya duyarlı olduğunu bildirdi. Isı işleminin ayrıca tohum unundaki mirosinaz enzimini denatüre etmesi ve glukozinolatların reaktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizini önlemesi beklenmektedir. Bu aynı zamanda Okunade ve arkadaşları 75 tarafından da doğrulandı. mirosinazın sıcaklığa duyarlı olduğunu gösterdiler ve hardal, siyah hardal ve kan kökü tohumları 80°C'nin üzerindeki sıcaklıklara maruz bırakıldığında mirosinaz aktivitesinin tamamen inaktive olduğunu gösterdiler. Bu mekanizmalar ısıyla işlenmiş DFP tohum ununun insektisidal aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Bu nedenle, hardal tohumu unu ve üç ana izotiyosiyanatı sivrisinek larvaları için toksiktir. Tohum unu ile kimyasal uygulamalar arasındaki bu farklılıklar göz önüne alındığında, tohum unu kullanımı sivrisinek kontrolünde etkili bir yöntem olabilir. Tohum tozlarının kullanımının etkinliğini ve stabilitesini artırmak için uygun formülasyonların ve etkili dağıtım sistemlerinin belirlenmesine ihtiyaç vardır. Sonuçlarımız, hardal tohumu unu'nun sentetik pestisitlere bir alternatif olarak potansiyel kullanımını göstermektedir. Bu teknoloji, sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi bir araç haline gelebilir. Sivrisinek larvaları sucul ortamlarda geliştiğinden ve tohum unu glukozinolatları hidrasyon üzerine enzimatik olarak aktif izotiyosiyanatlara dönüştürüldüğünden, sivrisinek istilasına uğramış sularda hardal tohumu unu kullanımı önemli bir kontrol potansiyeli sunar. İzotiyosiyanatların larvisit aktivitesi değişmekle birlikte (BITC > AITC > 4-HBITC), tohum unu ile birden fazla glukozinolatın birleştirilmesinin sinerjik olarak toksisiteyi artırıp artırmadığını belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu, yağı alınmış turpgiller tohumu küspesi ve üç biyoaktif izotiyosiyanatın sivrisinekler üzerindeki böcek öldürücü etkilerini gösteren ilk çalışmadır. Bu çalışmanın sonuçları, tohumlardan yağ çıkarmanın bir yan ürünü olan yağı alınmış lahana tohumu küspesinin sivrisinek kontrolü için umut verici bir larvisit ajan olarak kullanılabileceğini göstererek çığır açmaktadır. Bu bilgiler, bitki biyokontrol ajanlarının keşfine ve bunların ucuz, pratik ve çevre dostu biyopestisitler olarak geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Bu çalışma için oluşturulan veri setleri ve elde edilen analizler, makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Çalışmanın sonunda, çalışmada kullanılan tüm materyaller (böcekler ve tohum unu) imha edilmiştir.
Gönderi zamanı: 29 Temmuz 2024