Etkili bir şekildesivrisinekleri kontrol etmekve taşıdıkları hastalıkların görülme sıklığını azaltmak için kimyasal pestisitlere stratejik, sürdürülebilir ve çevre dostu alternatiflere ihtiyaç duyulmaktadır. Mısır Aedes'inin (L., 1762) kontrolünde kullanılmak üzere biyolojik olarak inaktif glukozinolatların enzimatik hidrolizi ile üretilen bitki kaynaklı izotiyosiyanatların bir kaynağı olarak belirli Brassicaceae'den (Brassica familyası) elde edilen tohum yemeklerini değerlendirdik. Beş yağsız tohum unu (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ve Thlaspi arvense – üç ana termal inaktivasyon ve enzimatik bozunma tipi Kimyasal ürünler Allil izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanatın Aedes aegypti larvalarına 24 saatlik maruziyette toksisitesini (LC50) belirlemek için = 0,04 g/120 ml dH2O). Hardal, beyaz hardal ve atkuyruğu için LC50 değerleri. Tohum unu, allil izotiyosiyanat (LC50 = 19,35 ppm) ve 4.-Hidroksibenzilizotiyosiyanat (LC50 = 55,41 ppm) ile karşılaştırıldığında sırasıyla 0,05, 0,08 ve 0,05 idi. 24 saat sonra sırasıyla 0,1 g/120 ml dH2O'dan larvalar için daha toksikti. Bu sonuçlar yonca tohumu unu üretimi ile tutarlıdır. Benzil esterlerin daha yüksek verimliliği hesaplanan LC50 değerlerine karşılık gelmektedir. Tohum unu kullanımı, sivrisinek kontrolünde etkili bir yöntem sağlayabilir. Turpgillerden tohum tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliği ve turpgillerden tohum tozundaki doğal bileşiklerin sivrisinek kontrolü için nasıl çevre dostu bir larvisit olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.
Aedes sivrisineklerinin neden olduğu vektör kaynaklı hastalıklar önemli bir küresel halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Sivrisinek kaynaklı hastalıkların görülme sıklığı coğrafi olarak yayılmaktadır1,2,3 ve tekrar ortaya çıkarak ciddi hastalık salgınlarına yol açmaktadır4,5,6,7. Hastalıkların insanlar ve hayvanlar arasında yayılması (örneğin, chikungunya, dang humması, Rift Vadisi ateşi, sarı humma ve Zika virüsü) benzeri görülmemiş düzeydedir. Sadece dang humması tropik bölgelerde yaklaşık 3,6 milyar insanı enfeksiyon riski altına sokmaktadır ve her yıl tahmini 390 milyon enfeksiyon meydana gelmekte ve yılda 6.100-24.300 ölüme neden olmaktadır8. Zika virüsünün Güney Amerika'da yeniden ortaya çıkması ve salgını, enfekte kadınların doğurduğu çocuklarda beyin hasarına neden olması nedeniyle dünya çapında ilgi çekmiştir2. Kremer ve diğerleri3 Aedes sivrisineklerinin coğrafi aralığının genişlemeye devam edeceğini ve 2050 yılına kadar dünya nüfusunun yarısının sivrisinek kaynaklı arbovirüsler tarafından enfeksiyon riski altında olacağını tahmin etmektedir.
Son zamanlarda geliştirilen dang humması ve sarı humma aşıları hariç, sivrisinek kaynaklı hastalıkların çoğuna karşı aşı henüz geliştirilmemiştir9,10,11. Aşılar hala sınırlı miktarlarda mevcuttur ve yalnızca klinik deneylerde kullanılır. Sentetik böcek öldürücüler kullanılarak sivrisinek vektörlerinin kontrolü, sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasını kontrol etmek için önemli bir strateji olmuştur12,13. Sentetik pestisitler sivrisinekleri öldürmede etkili olsa da, sentetik pestisitlerin sürekli kullanımı hedef dışı organizmaları olumsuz etkiler ve çevreyi kirletir14,15,16. Daha da endişe verici olanı, sivrisineklerin kimyasal böcek ilaçlarına karşı direncinin artması eğilimidir17,18,19. Pestisitlerle ilişkili bu sorunlar, hastalık vektörlerini kontrol etmek için etkili ve çevre dostu alternatifler arayışını hızlandırmıştır.
Çeşitli bitkiler zararlı böcek kontrolü için fitopestisit kaynakları olarak geliştirilmiştir20,21. Bitkisel maddeler genellikle biyolojik olarak parçalanabilir oldukları ve memeliler, balıklar ve amfibiler gibi hedef dışı organizmalar için düşük veya ihmal edilebilir toksisiteye sahip oldukları için çevre dostudur20,22. Bitkisel preparatların sivrisineklerin farklı yaşam evrelerini etkili bir şekilde kontrol etmek için farklı etki mekanizmalarına sahip çeşitli biyoaktif bileşikler ürettiği bilinmektedir23,24,25,26. Esansiyel yağlar ve diğer aktif bitki bileşenleri gibi bitki kaynaklı bileşikler dikkat çekmiş ve sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi araçların önünü açmıştır. Esansiyel yağlar, monoterpenler ve seskiterpenler kovucu, besleyici caydırıcı ve ovisitler olarak etki eder27,28,29,30,31,32,33. Birçok bitkisel yağ sivrisinek larvalarının, pupalarının ve yetişkinlerinin ölümüne neden olur34,35,36 ve böceklerin sinir, solunum, endokrin ve diğer önemli sistemlerini etkiler37.
Son çalışmalar hardal bitkilerinin ve tohumlarının biyoaktif bileşik kaynağı olarak potansiyel kullanımına ilişkin fikir sağlamıştır. Hardal tohumu unu bir biyofümigant38,39,40,41 olarak test edilmiş ve yabancı ot baskılama42,43,44 ve toprak kaynaklı bitki patojenlerinin kontrolü45,46,47,48,49,50, bitki beslenmesi için toprak düzenleyici olarak kullanılmıştır. nematodlar 41,51, 52, 53, 54 ve zararlılar 55, 56, 57, 58, 59, 60. Bu tohum tozlarının fungisidal aktivitesi izotiyosiyanatlar38,42,60 adı verilen bitki koruyucu bileşiklere atfedilmektedir. Bitkilerde, bu koruyucu bileşikler bitki hücrelerinde biyoaktif olmayan glukozinolatlar şeklinde depolanır. Ancak bitkiler böcek beslenmesi veya patojen enfeksiyonu nedeniyle zarar gördüğünde, glukozinolatlar mirosinaz tarafından biyoaktif izotiyosiyanatlara hidrolize edilir55,61. İzotiyosiyanatlar, geniş spektrumlu antimikrobiyal ve böcek öldürücü aktiviteye sahip olduğu bilinen uçucu bileşiklerdir ve yapıları, biyolojik aktiviteleri ve içerikleri Brassicaceae türleri arasında büyük ölçüde değişir42,59,62,63.
Hardal tohumu unundan elde edilen izotiyosiyanatların böcek öldürücü aktiviteye sahip olduğu bilinmesine rağmen, tıbbi açıdan önemli eklembacaklı vektörlere karşı biyolojik aktiviteye dair veriler eksiktir. Çalışmamızda, dört yağsız tohum tozunun Aedes sivrisineklerine karşı larvisit aktivitesi incelendi. Aedes aegypti larvaları. Çalışmanın amacı, sivrisinek kontrolünde çevre dostu biyopestisit olarak potansiyel kullanımlarını değerlendirmekti. Tohum ununun üç ana kimyasal bileşeni olan alil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilisotiyosiyanat (4-HBITC), bu kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvaları üzerindeki biyolojik aktivitesini test etmek için de test edildi. Bu, dört lahana tohumu tozunun ve ana kimyasal bileşenlerinin sivrisinek larvalarına karşı etkinliğini değerlendiren ilk rapordur.
Aedes aegypti'nin (Rockefeller suşu) laboratuvar kolonileri 26°C, %70 bağıl nem (RH) ve 10:14 saat (L:D fotoperiyodu) koşullarında tutuldu. Çiftleşen dişiler plastik kafeslerde (yükseklik 11 cm ve çap 9,5 cm) tutuldu ve sitratlı sığır kanı (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, ABD) kullanılarak bir şişe besleme sistemiyle beslendi. Kan beslemesi her zamanki gibi, sıcaklık kontrolü 37 °C olan bir sirkülasyonlu su banyosu tüpüne (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, ABD) bağlı bir membranlı çok camlı besleyici (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir cam besleme haznesinin (alan 154 mm2) altına bir Parafilm M filmi gerin. Daha sonra her bir besleyici, çiftleşen dişiyi içeren kafesi kaplayan üst ızgaraya yerleştirildi. Yaklaşık 350-400 μl sığır kanı bir Pasteur pipeti (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) kullanılarak cam besleme hunisine eklendi ve yetişkin solucanların en az bir saat boyunca süzülmesine izin verildi. Gebe dişilere daha sonra %10'luk bir sakaroz çözeltisi verildi ve ayrı ayrı ultra şeffaf sufle kaplarına (1,25 fl oz boyutu, Dart Container Corp., Mason, MI, ABD) yerleştirilmiş nemli filtre kağıdına yumurta bırakmalarına izin verildi. su dolu kafese koyun. Yumurta içeren filtre kağıdını kapalı bir torbaya (SC Johnsons, Racine, WI) koyun ve 26°C'de saklayın. Yumurtalar çatladı ve yaklaşık 200-250 larva, tavşan yemi (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ABD) ve karaciğer tozu (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ABD) karışımı içeren plastik tepsilerde büyütüldü. ve balık filetosu (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Almanya) 2:1:1 oranında. Biyolojik denemelerimizde geç üçüncü instar larvaları kullanıldı.
Bu çalışmada kullanılan bitki tohumu materyali aşağıdaki ticari ve hükümet kaynaklarından elde edilmiştir: Brassica juncea (kahverengi hardal-Pacific Gold) ve Brassica juncea (beyaz hardal-Ida Gold), Pasifik Kuzeybatısı Çiftçi Kooperatifi, Washington Eyaleti, ABD; (Garden Cress), Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, ABD ve Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth), USDA-ARS, Peoria, IL, ABD; Çalışmada kullanılan tohumların hiçbiri pestisitlerle işlenmemiştir. Tüm tohum materyali, yerel ve ulusal düzenlemelere ve tüm ilgili yerel, eyalet ve ulusal düzenlemelere uygun olarak bu çalışmada işlenmiş ve kullanılmıştır. Bu çalışmada transgenik bitki çeşitleri incelenmemiştir.
Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Beyaz hardal (IG), Thlaspi arvense (DFP) tohumları, 0,75 mm gözenekli ve paslanmaz çelik rotorlu, 12 dişli, 10.000 rpm'lik bir Retsch ZM200 ultra santrifüj değirmeni (Retsch, Haan, Almanya) kullanılarak ince bir toz haline getirildi (Tablo 1). Öğütülmüş tohum tozu bir kağıt yüksüğe aktarıldı ve 24 saat boyunca bir Soxhlet cihazında heksanla yağdan arındırıldı. Yağdan arındırılmış bir tarla hardalı alt örneği, mirosinazı denatüre etmek ve glukozinolatların biyolojik olarak aktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizini önlemek için 100 °C'de 1 saat boyunca ısıl işleme tabi tutuldu. Isıl işlem görmüş atkuyruğu tohumu tozu (DFP-HT), mirosinazı denatüre ederek negatif kontrol olarak kullanıldı.
Yağdan arındırılmış tohum unu içindeki glukozinolat içeriği, daha önce yayınlanmış bir protokole 64 göre yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak üç kez belirlendi. Kısaca, 250 mg yağdan arındırılmış tohum tozu örneğine 3 mL metanol eklendi. Her örnek 30 dakika su banyosunda sonikasyona tabi tutuldu ve 16 saat boyunca 23°C'de karanlıkta bırakıldı. Daha sonra organik katmanın 1 mL'lik bir kısmı 0,45 μm'lik bir filtreden otomatik örnekleyiciye filtrelendi. Bir Shimadzu HPLC sistemi (iki LC 20AD pompası; SIL 20A otomatik örnekleyici; DGU 20As gaz giderici; 237 nm'de izleme için SPD-20A UV-VIS dedektörü; ve CBM-20A iletişim veri yolu modülü) çalıştırılarak, tohum unu içindeki glukozinolat içeriği üç kez belirlendi. Shimadzu LC Solution yazılım sürümü 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, ABD) kullanılarak. Kolon, C18 Inertsil ters faz kolonuydu (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ABD). İlk hareketli faz koşulları, 1 mL/dakika akış hızıyla suda %12 metanol/%88 0,01 M tetrabutilamonyum hidroksit (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) olarak ayarlandı. 15 μl numune enjeksiyonundan sonra, ilk koşullar 20 dakika boyunca korundu ve ardından çözücü oranı, toplam numune analiz süresi 65 dakika olacak şekilde %100 metanole ayarlandı. Yağsız tohum unu kükürt içeriğini tahmin etmek için taze hazırlanmış sinapin, glukozinolat ve mirosin standartlarının (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) seri seyreltileriyle bir standart eğri (nM/mAb bazlı) oluşturuldu. glukozinolatlar. Örneklerdeki glukozinolat konsantrasyonları, aynı kolonla donatılmış ve daha önce açıklanan bir yöntem kullanılarak OpenLAB CDS ChemStation sürümü (C.01.07 SR2 [255]) kullanılarak bir Agilent 1100 HPLC'de (Agilent, Santa Clara, CA, ABD) test edildi. Glukozinolat konsantrasyonları belirlendi; HPLC sistemleri arasında karşılaştırılabilir olmalıdır.
Allil izotiyosiyanat (%94, kararlı) ve benzil izotiyosiyanat (%98) Fisher Scientific'ten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) satın alındı. 4-Hidroksibenzilizotiyosiyanat ChemCruz'dan (Santa Cruz Biotechnology, CA, ABD) satın alındı. Mirosinaz tarafından enzimatik olarak hidrolize edildiğinde, glukozinolatlar, glukozinolatlar ve glukozinolatlar sırasıyla alil izotiyosiyanat, benzil izotiyosiyanat ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat oluşturur.
Laboratuvar biyolojik denemeleri Muturi ve ark.'nın 32 modifikasyonlu yöntemine göre gerçekleştirildi. Çalışmada beş düşük yağlı tohum yemi kullanıldı: DFP, DFP-HT, IG, PG ve Ls. Yirmi larva, 120 mL deiyonize su (dH2O) içeren 400 mL tek kullanımlık üç yollu bir behere (VWR International, LLC, Radnor, PA, ABD) yerleştirildi. Sivrisinek larva toksisitesi için yedi tohum unu konsantrasyonu test edildi: DFP tohum unu, DFP-HT, IG ve PG için 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 ve 0,12 g tohum unu/120 ml dH2O. Ön biyolojik denemeler, yağsızlaştırılmış Ls tohum ununun test edilen diğer dört tohum unundan daha toksik olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Ls tohum unu için yedi uygulama konsantrasyonunu şu konsantrasyonlara ayarladık: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 ve 0,075 g/120 mL dH2O.
Deney koşulları altında normal böcek ölüm oranını değerlendirmek için işlem görmemiş bir kontrol grubu (dH20, tohum unu takviyesi yok) dahil edildi. Her tohum unu için toksikolojik biyolojik deneyler, toplam 108 şişe için üç tekrarlı üç eğimli beher (beher beherde 20 geç üçüncü instar larva) içeriyordu. İşlem görmüş kaplar oda sıcaklığında (20-21 °C) saklandı ve larva ölümleri, işlem konsantrasyonlarına sürekli maruz kalmanın 24 ve 72 saati boyunca kaydedildi. Sivrisineğin vücudu ve uzantıları ince paslanmaz çelik bir spatula ile delindiğinde veya dokunulduğunda hareket etmiyorsa, sivrisinek larvaları ölü kabul edilir. Ölü larvalar genellikle kabın dibinde veya su yüzeyinde dorsal veya ventral pozisyonda hareketsiz kalır. Deney, her bir işlem konsantrasyonuna maruz bırakılan toplam 180 larva için farklı larva grupları kullanılarak farklı günlerde üç kez tekrarlandı.
AITC, BITC ve 4-HBITC'in sivrisinek larvalarına olan toksisitesi aynı biyolojik deney prosedürü kullanılarak ancak farklı işlemlerle değerlendirildi. Her kimyasal için 100.000 ppm'lik stok solüsyonları hazırlayın; bunun için 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde 900 µL mutlak etanole 100 µL kimyasal ekleyin ve iyice karışması için 30 saniye çalkalayın. İşlem konsantrasyonları, BITC'nin AITC ve 4-HBITC'den çok daha toksik olduğunu bulan ön biyolojik deneylerimize dayanarak belirlendi. Toksisiteyi belirlemek için 5 BITC konsantrasyonu (1, 3, 6, 9 ve 12 ppm), 7 AITC konsantrasyonu (5, 10, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) ve 6 4-HBITC konsantrasyonu (15, 15, 20, 25, 30 ve 35 ppm) kullanıldı. 30, 45, 60, 75 ve 90 ppm). Kontrol işlemine, kimyasal işlemin maksimum hacmine eşdeğer olan 108 μL mutlak etanol enjekte edildi. Biyolojik analizler, her işlem konsantrasyonu için toplam 180 larva açığa çıkarılarak yukarıdaki gibi tekrarlandı. Larval ölüm oranı, 24 saatlik sürekli maruziyetten sonra her AITC, BITC ve 4-HBITC konsantrasyonu için kaydedildi.
65 dozla ilişkili ölüm verisinin probit analizi, %50 öldürücü konsantrasyon (LC50), %90 öldürücü konsantrasyon (LC90), eğim, öldürücü doz katsayısı ve %95 öldürücü konsantrasyonu hesaplamak için Polo yazılımı (Polo Plus, LeOra Yazılımı, sürüm 1.0) kullanılarak gerçekleştirildi. logaritmik dönüştürülmüş konsantrasyon ve doz-ölüm eğrileri için öldürücü doz oranlarına ilişkin güven aralıklarına dayanmaktadır. Ölüm verileri, her bir uygulama konsantrasyonuna maruz bırakılan 180 larvanın birleştirilmiş tekrar verilerine dayanmaktadır. Olasılıksal analizler, her bir tohum unu ve her bir kimyasal bileşen için ayrı ayrı gerçekleştirildi. Öldürücü doz oranının %95 güven aralığına dayanarak, tohum unu ve kimyasal bileşenlerin sivrisinek larvalarına olan toksisitesinin önemli ölçüde farklı olduğu düşünüldü, bu nedenle 1 değerini içeren bir güven aralığı önemli ölçüde farklı değildi, P = 0,0566.
Yağsız tohum unları DFP, IG, PG ve Ls'deki majör glukozinolatların belirlenmesi için HPLC sonuçları Tablo 1'de listelenmiştir. Test edilen tohum unlarındaki majör glukozinolatlar, her ikisi de mirosinaz glukozinolatları içeren DFP ve PG hariç, değişiklik göstermiştir. PG'deki mirosin içeriği DFP'dekinden daha yüksekti, sırasıyla 33,3 ± 1,5 ve 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls tohum tozu 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikon içerirken, IG tohum tozu 38,0 ± 0,5 mg/g sinapin içeriyordu.
Ae. Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları, yağsız tohum unu ile muamele edildiğinde öldürüldü, ancak muamelenin etkinliği bitki türlerine bağlı olarak değişti. Sadece DFP-NT, 24 ve 72 saatlik maruziyetten sonra sivrisinek larvaları için toksik değildi (Tablo 2). Aktif tohum tozunun toksisitesi, artan konsantrasyonla arttı (Şekil 1A, B). Tohum ununun sivrisinek larvalarına olan toksisitesi, 24 saatlik ve 72 saatlik değerlendirmelerde LC50 değerlerinin letal doz oranının %95 CI'sına göre önemli ölçüde değişti (Tablo 3). 24 saat sonra, Ls tohum unu toksik etkisi, en yüksek aktivite ve larvalar için maksimum toksisite (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O) ile diğer tohum unu muamelelerinden daha büyüktü. Larvalar, IG, Ls ve PG tohum tozu uygulamalarına kıyasla 24 saatte DFP'ye daha az duyarlıydı, LC50 değerleri sırasıyla 0,115, 0,04 ve 0,08 g/120 ml dH2O idi ve bu değerler istatistiksel olarak LC50 değerinden yüksekti. 0,211 g/120 ml dH2O (Tablo 3). DFP, IG, PG ve Ls'nin LC90 değerleri ise sırasıyla 0,376, 0,275, 0,137 ve 0,074 g/120 ml dH2O idi (Tablo 2). En yüksek DPP konsantrasyonu 0,12 g/120 ml dH2O idi. 24 saatlik değerlendirmeden sonra, ortalama larva ölüm oranı sadece %12 iken, IG ve PG larvalarının ortalama ölüm oranı sırasıyla %51 ve %82'ye ulaştı. 24 saatlik değerlendirmeden sonra, en yüksek Ls tohum unu konsantrasyonunda (0,075 g/120 ml dH2O) ortalama larva ölüm oranı %99 olarak bulundu (Şekil 1A).
Ölümlülük eğrileri, Ae. Mısır larvalarının (3. instar larvaları) doz yanıtından (Probit) tedaviden 24 saat (A) ve 72 saat (B) sonra tohum unu konsantrasyonuna göre tahmin edilmiştir. Noktalı çizgi tohum unu tedavisinin LC50'sini temsil eder. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Isı ile inaktive edilmiş Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
72 saatlik değerlendirmede, DFP, IG ve PG tohum unu için LC50 değerleri sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,051 g/120 ml dH2O olarak bulundu. Ls tohum unu maruziyetine maruz bırakılan larvaların hemen hemen tamamı 72 saatlik maruziyetten sonra öldüğünden, ölüm verileri Probit analiziyle tutarsızdı. Diğer tohum unu ile karşılaştırıldığında, larvalar DFP tohum unu uygulamasına daha az duyarlıydı ve istatistiksel olarak daha yüksek LC50 değerlerine sahipti (Tablo 2 ve 3). 72 saat sonra, DFP, IG ve PG tohum unu uygulamaları için LC50 değerlerinin sırasıyla 0,111, 0,085 ve 0,05 g/120 ml dH2O olduğu tahmin edildi. 72 saatlik değerlendirmeden sonra, DFP, IG ve PG tohum tozlarının LC90 değerleri sırasıyla 0,215, 0,254 ve 0,138 g/120 ml dH2O olarak bulundu. 72 saatlik değerlendirmeden sonra, maksimum 0,12 g/120 ml dH2O konsantrasyonunda DFP, IG ve PG tohum unu uygulamaları için ortalama larval ölüm oranı sırasıyla %58, %66 ve %96 olarak bulundu (Şekil 1B). 72 saatlik değerlendirmeden sonra, PG tohum unu, IG ve DFP tohum unu'ndan daha toksik bulundu.
Sentetik izotiyosiyanatlar, allil izotiyosiyanat (AITC), benzil izotiyosiyanat (BITC) ve 4-hidroksibenzilizotiyosiyanat (4-HBITC) sivrisinek larvalarını etkili bir şekilde öldürebilir. Tedaviden 24 saat sonra, BITC, AITC için 19,35 ppm ve 4-HBITC için 55,41 ppm'ye kıyasla 5,29 ppm'lik bir LC50 değeriyle larvalar için daha toksikti (Tablo 4). AITC ve BITC ile karşılaştırıldığında, 4-HBITC daha düşük toksisiteye ve daha yüksek bir LC50 değerine sahiptir. En etkili tohum unu içindeki iki ana izotiyosiyanatın (Ls ve PG) sivrisinek larva toksisitesinde önemli farklılıklar vardır. AITC, BITC ve 4-HBITC arasındaki LC50 değerlerinin letal doz oranına dayalı toksisite, LC50 letal doz oranının %95 CI'sinin 1 değerini içermediği şekilde istatistiksel bir fark gösterdi (P = 0,05, Tablo 4). Hem BITC hem de AITC'nin en yüksek konsantrasyonlarının test edilen larvaların %100'ünü öldürdüğü tahmin edildi (Şekil 2).
Ölüm eğrileri Ae'nin doz yanıtından (Probit) tahmin edildi. Tedaviden 24 saat sonra, Mısır larvaları (3. instar larvaları) sentetik izotiyosiyanat konsantrasyonlarına ulaştı. Noktalı çizgi izotiyosiyanat tedavisi için LC50'yi temsil eder. Benzil izotiyosiyanat BITC, alil izotiyosiyanat AITC ve 4-HBITC.
Bitki biyopestisitlerinin sivrisinek vektör kontrol ajanları olarak kullanımı uzun zamandır araştırılmaktadır. Birçok bitki böcek öldürücü aktiviteye sahip doğal kimyasallar üretir37. Biyoaktif bileşikleri, sivrisinekler de dahil olmak üzere zararlıları kontrol etmede büyük potansiyele sahip sentetik böcek öldürücülere çekici bir alternatif sunar.
Hardal bitkileri tohumları için bir ürün olarak yetiştirilir, baharat ve yağ kaynağı olarak kullanılır. Hardal yağı tohumlardan çıkarıldığında veya hardal biyoyakıt olarak kullanılmak üzere çıkarıldığında, 69 yan ürün yağsız tohum unu olur. Bu tohum unu, doğal biyokimyasal bileşenlerinin ve hidrolitik enzimlerinin çoğunu korur. Bu tohum unu toksisitesi izotiyosiyanatların üretimine atfedilir55,60,61. İzotiyosiyanatlar, tohum unu hidrasyonu sırasında enzim mirosinaz tarafından glukozinolatların hidrolizi ile oluşur38,55,70 ve fungisidal, bakterisidal, nematisidal ve böcek öldürücü etkilerinin yanı sıra kimyasal duyusal etkiler ve kemoterapötik özellikler de dahil olmak üzere diğer özelliklere sahip oldukları bilinmektedir61,62,70. Birkaç çalışma, hardal bitkilerinin ve tohum unu'nun toprak ve depolanmış gıda zararlılarına karşı etkili bir şekilde fumigant olarak hareket ettiğini göstermiştir57,59,71,72. Bu çalışmada, dört tohumlu un ve üç biyoaktif ürünü olan AITC, BITC ve 4-HBITC'nin Aedes sivrisinek larvalarına olan toksisitesini değerlendirdik. Aedes aegypti. Sivrisinek larvaları içeren suya doğrudan tohum unu eklenmesinin, sivrisinek larvaları için toksik olan izotiyosiyanatlar üreten enzimatik süreçleri aktive etmesi beklenir. Bu biyotransformasyon, kısmen tohum ununun gözlemlenen larvisital aktivitesi ve cüce hardal tohumu unu kullanılmadan önce ısıl işleme tabi tutulduğunda insektisit aktivitesinin kaybı ile gösterilmiştir. Isıl işlemin, glukozinolatları aktive eden hidrolitik enzimleri yok etmesi ve böylece biyoaktif izotiyosiyanatların oluşumunu engellemesi beklenir. Bu, lahana tohumu tozunun su ortamında sivrisineklere karşı insektisit özelliklerini doğrulayan ilk çalışmadır.
Test edilen tohum tozları arasında, su teresi tohumu tozu (Ls) en toksik olanıydı ve Aedes albopictus'un yüksek oranda ölümüne neden oldu. Aedes aegypti larvaları 24 saat boyunca sürekli olarak işlendi. Geriye kalan üç tohum tozu (PG, IG ve DFP) daha yavaş aktiviteye sahipti ve 72 saatlik sürekli işlemden sonra bile önemli oranda ölüme neden oldu. Sadece Ls tohum unu önemli miktarda glukozinolat içeriyordu, oysa PG ve DFP mirosinaz içeriyordu ve IG majör glukozinolat olarak glukozinolat içeriyordu (Tablo 1). Glukotropaeolin BITC'ye hidrolize edilir ve sinalbin 4-HBITC61,62'ye hidrolize edilir. Biyolojik deney sonuçlarımız hem Ls tohum unu hem de sentetik BITC'nin sivrisinek larvaları için oldukça toksik olduğunu göstermektedir. PG ve DFP tohum unu ana bileşeni AITC'ye hidrolize edilen mirosinaz glukozinolattır. AITC, 19.35 ppm'lik bir LC50 değeriyle sivrisinek larvalarını öldürmede etkilidir. AITC ve BITC ile karşılaştırıldığında, 4-HBITC izotiyosiyanat larvalar için en az toksik olanıdır. AITC, BITC'den daha az toksik olmasına rağmen, LC50 değerleri sivrisinek larvaları üzerinde test edilen birçok uçucu yağdan daha düşüktür32,73,74,75.
Sivrisinek larvalarına karşı kullanılmak üzere turpgillerden elde ettiğimiz tohum tozu, HPLC ile belirlenen toplam glukozinolatların %98-99'undan fazlasını oluşturan bir ana glukozinolat içerir. Diğer glukozinolatların eser miktarları tespit edildi, ancak bunların seviyeleri toplam glukozinolatların %0,3'ünden azdı. Tere (L. sativum) tohum tozu ikincil glukozinolatlar (sinigrin) içerir, ancak bunların oranı toplam glukozinolatların %1'idir ve içerikleri hala önemsizdir (yaklaşık 0,4 mg/g tohum tozu). PG ve DFP aynı ana glukozinolat (mirosin) içermesine rağmen, tohum öğünlerinin larvisit aktivitesi LC50 değerleri nedeniyle önemli ölçüde farklılık gösterir. Toz halinde küflenmeye karşı toksisitesi değişir. Aedes aegypti larvalarının ortaya çıkması, iki tohum yemi arasındaki mirosinaz aktivitesi veya stabilitesindeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. Mirosinaz aktivitesi, Brassicaceae bitkilerinde izotiyosiyanatlar gibi hidroliz ürünlerinin biyoyararlanımında önemli bir rol oynar76. Pocock ve ark.77 ve Wilkinson ve ark.78 tarafından yapılan önceki raporlar, mirosinaz aktivitesindeki ve stabilitesindeki değişikliklerin genetik ve çevresel faktörlerle de ilişkili olabileceğini göstermiştir.
Beklenen biyoaktif izotiyosiyanat içeriği, karşılık gelen kimyasal uygulamalarla karşılaştırmak amacıyla, her bir tohum ununun 24 ve 72 saatteki LC50 değerlerine göre hesaplandı (Tablo 5). 24 saat sonra, tohum ununda bulunan izotiyosiyanatlar, saf bileşiklerden daha toksikti. İzotiyosiyanat tohum uygulamalarının milyonda bir parça (ppm) bazında hesaplanan LC50 değerleri, BITC, AITC ve 4-HBITC uygulamaları için hesaplanan LC50 değerlerinden daha düşüktü. Larvaların tohum unu peletlerini tükettiğini gözlemledik (Şekil 3A). Sonuç olarak, larvalar tohum unu peletlerini yutarak toksik izotiyosiyanatlara daha yoğun bir şekilde maruz kalabilirler. Bu, 24 saatlik maruziyette IG ve PG tohum unu uygulamalarında en belirgindi; burada LC50 konsantrasyonları sırasıyla saf AITC ve 4-HBITC uygulamalarından %75 ve %72 daha düşüktü. Ls ve DFP uygulamaları saf izotiyosiyanattan daha toksikti, LC50 değerleri sırasıyla %24 ve %41 daha düşüktü. Kontrol uygulamasındaki larvalar başarılı bir şekilde pupa oldu (Şekil 3B), tohum unu uygulamasındaki larvaların çoğu pupa olmadı ve larval gelişim önemli ölçüde gecikti (Şekil 3B,D). Spodopteralitura'da izotiyosiyanatlar büyüme geriliği ve gelişimsel gecikme ile ilişkilidir79.
Ae. Aedes aegypti sivrisineklerinin larvaları 24-72 saat boyunca sürekli olarak Brassica tohum tozuna maruz bırakıldı. (A) Ağız kısımlarında tohum unu parçacıkları bulunan ölü larvalar (daire içine alınmış); (B) Kontrol uygulaması (tohum unu eklenmemiş dH20) larvaların normal şekilde büyüdüğünü ve 72 saat sonra pupa olmaya başladığını gösteriyor (C, D) Tohum unu ile tedavi edilen larvalar; tohum unu gelişimde farklılıklar gösterdi ve pupa olmadı.
Sivrisinek larvaları üzerindeki izotiyosiyanatların toksik etkilerinin mekanizmasını incelemedik. Ancak, kırmızı ateş karıncaları (Solenopsis invicta) üzerinde yapılan önceki çalışmalar, glutatyon S-transferaz (GST) ve esteraz (EST) inhibisyonunun izotiyosiyanat biyoaktivitesinin ana mekanizması olduğunu ve AITC'nin düşük aktivitede bile GST aktivitesini inhibe edebileceğini göstermiştir. düşük konsantrasyonlarda kırmızı ithal ateş karıncaları. Doz 0,5 µg/ml'dir80. Buna karşılık, AITC yetişkin mısır böceklerinde (Sitophilus zeamais) asetilkolinesterazı inhibe eder81. Sivrisinek larvalarında izotiyosiyanat aktivitesinin mekanizmasını açıklamak için benzer çalışmalar yapılmalıdır.
Bitki glukozinolatlarının reaktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizinin, hardal tohumu unu ile sivrisinek larvalarının kontrolü için bir mekanizma görevi gördüğü önerisini desteklemek için ısıyla inaktive edilmiş DFP işlemini kullanıyoruz. DFP-HT tohum unu, test edilen uygulama oranlarında toksik değildi. Lafarga ve ark. 82, glukozinolatların yüksek sıcaklıklarda bozulmaya duyarlı olduğunu bildirdi. Isı işleminin ayrıca tohum ununda mirosinaz enzimini denatüre etmesi ve glukozinolatların reaktif izotiyosiyanatlar oluşturmak üzere hidrolizini önlemesi beklenmektedir. Bu, Okunade ve ark. 75 tarafından da doğrulandı. mirosinazın sıcaklığa duyarlı olduğunu gösterdi ve hardal, siyah hardal ve kan kökü tohumları 80° C'nin üzerindeki sıcaklıklara maruz bırakıldığında mirosinaz aktivitesinin tamamen inaktive olduğunu gösterdi. Bu mekanizmalar, ısıyla işlenmiş DFP tohum ununun böcek öldürücü aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Bu nedenle, hardal tohumu unu ve üç ana izotiyosiyanatı sivrisinek larvaları için toksiktir. Tohum unu ile kimyasal işlemler arasındaki bu farklılıklar göz önüne alındığında, tohum unu kullanımı sivrisinek kontrolünde etkili bir yöntem olabilir. Tohum tozlarının kullanımının etkinliğini ve stabilitesini iyileştirmek için uygun formülasyonların ve etkili dağıtım sistemlerinin belirlenmesine ihtiyaç vardır. Sonuçlarımız, hardal tohumu unu kullanımının sentetik pestisitlere bir alternatif olarak potansiyel kullanımını göstermektedir. Bu teknoloji, sivrisinek vektörlerini kontrol etmek için yenilikçi bir araç haline gelebilir. Sivrisinek larvaları sucul ortamlarda geliştiğinden ve tohum unu glukozinolatları hidrasyon üzerine enzimatik olarak aktif izotiyosiyanatlara dönüştürüldüğünden, sivrisinek istilasına uğramış suda hardal tohumu unu kullanımı önemli bir kontrol potansiyeli sunar. İzotiyosiyanatların larvisit aktivitesi değişse de (BITC > AITC > 4-HBITC), tohum unu ile birden fazla glukozinolatın birleştirilmesinin sinerjik olarak toksisiteyi artırıp artırmadığını belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu, yağsız turpgiller tohumu unu ve üç biyoaktif izotiyosiyanatın sivrisinekler üzerindeki böcek öldürücü etkilerini gösteren ilk çalışmadır. Bu çalışmanın sonuçları, tohumlardan yağ çıkarma işleminin bir yan ürünü olan yağsız lahana tohumu unu'nun sivrisinek kontrolü için umut vadeden bir larvisit ajanı olarak hizmet edebileceğini göstererek yeni bir çığır açmaktadır. Bu bilgi, bitki biyokontrol ajanlarının keşfini ve bunların ucuz, pratik ve çevre dostu biyopestisitler olarak geliştirilmesini ilerletmeye yardımcı olabilir.
Bu çalışma için oluşturulan veri kümeleri ve elde edilen analizler makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Çalışmanın sonunda, çalışmada kullanılan tüm materyaller (böcekler ve tohum unu) imha edildi.
Gönderi zamanı: 29-Tem-2024