Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi sonuçlar için tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modu'nu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stil veya JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Doğal ürünlerin keşfi ve faydalı kullanımı insan yaşamını iyileştirmeye yardımcı olabilir. Bitki büyümesini engelleyen kimyasallar, yabani otları kontrol etmek için herbisit olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı herbisit türlerinin kullanılması ihtiyacı nedeniyle, yeni etki mekanizmalarına sahip bileşiklerin belirlenmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1'den yeni bir N-alkoksipirol bileşiği olan kumaramonamidi keşfettik ve sentez sürecini tamamen oluşturduk. Biyolojik aktivite deneyleri yoluyla, urs-monoamik asidin urs-monoamidin sentetik bir ara ürünü olduğunu ve potansiyel bir urs-monoamid olduğunu keşfettik.bitki büyüme inhibitörüAyrıca, HeLa hücrelerinin büyümesini olumsuz etkilemeden yüksek herbisit aktivitesine sahip urbeniloksi türevi (UDA) de dahil olmak üzere çeşitli urbenonik asit türevleri geliştirdik. Ayrıca, urmotonik asit türevlerinin bitki mikrotübüllerini bozduğunu; KAND'ın aktin filamentlerini etkileyerek hücre ölümüne neden olduğunu; bu çok yönlü etkilerin, bilinen mikrotübül inhibitörlerinin etkilerinden farklı olduğunu ve ursonik asit için yeni bir etki mekanizması önerdiğini, bu da yeni herbisitlerin geliştirilmesinde önemli bir avantaj sağladığını ortaya koymaktadır.
Faydalı doğal ürünlerin ve türevlerinin keşfi ve pratik uygulaması, insan yaşam kalitesini iyileştirmenin bir yoludur. Mikroorganizmalar, bitkiler ve böcekler tarafından üretilen sekonder metabolitler, tıp ve tarımda büyük ilerlemelere yol açmıştır. Doğal ürünlerden birçok antibiyotik ve lösemi ilacı geliştirilmiştir. Ayrıca, çeşitli türlerdepestisitlerBu doğal ürünlerden tarımda kullanılmak üzere fungisitler ve herbisitler elde edilir. Özellikle yabancı ot kontrol herbisitleri, modern tarımda ürün verimini artırmak için önemli araçlardır ve çeşitli bileşik türleri halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır. Bitkilerde fotosentez, amino asit metabolizması, hücre duvarı sentezi, mitozun düzenlenmesi, fitohormon sinyalizasyonu veya protein sentezi gibi çeşitli hücresel süreçler, herbisitlerin tipik hedefleri olarak kabul edilir. Mikrotübül fonksiyonunu engelleyen bileşikler, mitotik düzenlemeyi etkileyerek bitki büyümesini etkileyen yaygın bir herbisit sınıfıdır2.
Mikrotübüller, sitoskeletonun bileşenleridir ve ökaryotik hücrelerde yaygın olarak korunurlar. Tübülin heterodimeri, 13 protofilamentin silindirik bir yapı oluşturduğu doğrusal mikrotübül protofilamentleri oluşturan α-tübülin ve β-tübülinden oluşur. Mikrotübüller, bitki hücrelerinde hücre şeklini, hücre bölünmesini ve hücre içi taşımayı belirlemek de dahil olmak üzere birçok rol oynar3,4. Bitki hücreleri, interfaz plazma membranının altında mikrotübüller içerir ve bu sözde kortikal mikrotübüllerin, selüloz sentaz komplekslerinin düzenlenmesi yoluyla selüloz mikrofibrillerinin organizasyonunu kontrol ettiği düşünülmektedir4,5. Kök ucunun hızlı uzama bölgesinde bulunan kök epidermal hücrelerinin kortikal mikrotübülleri yanal olarak yerleşmiştir ve selüloz mikrolifleri bu mikrotübülleri takip ederek hücre genişleme yönünü sınırlayarak anizotropik hücre uzamasını destekler. Bu nedenle, mikrotübül işlevi bitki morfolojisiyle yakından ilişkilidir. Tübülin kodlayan genlerdeki amino asit değişimleri, kortikal mikrotübül dizilerinin çarpıklığına ve Arabidopsis'te sol veya sağ taraflı büyümeye neden olur6,7. Benzer şekilde, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen mikrotübülle ilişkili proteinlerdeki mutasyonlar da çarpık kök büyümesine yol açabilir8,9,10,11,12,13. Ayrıca, pretilaklor olarak da bilinen disopiramid gibi mikrotübül bozucu herbisitlerle yapılan tedavi de sol taraflı eğik kök büyümesine neden olur14. Bu veriler, mikrotübül fonksiyonunun hassas bir şekilde düzenlenmesinin, bitki büyüme yönünün belirlenmesinde kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.
Çeşitli mikrotübül inhibitörleri keşfedilmiş ve bu ilaçlar sitoskeletal araştırmaların yanı sıra tarım ve tıp alanına da önemli katkılarda bulunmuştur.2 Özellikle orizalin, dinitroanilin bileşikleri, disopiramid, benzamid benzeri bileşikler ve bunların analogları, mikrotübül fonksiyonunu inhibe ederek bitki büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, herbisit olarak yaygın olarak kullanılırlar. Ancak, mikrotübüller bitki ve hayvan hücrelerinin önemli bir bileşeni olduğundan, çoğu mikrotübül inhibitörü her iki hücre tipi için de sitotoksiktir. Bu nedenle, herbisit olarak bilinen faydalarına rağmen, pratik amaçlar için sınırlı sayıda antimikrotübül ajanı kullanılmaktadır.
Streptomyces, aerobik, gram pozitif, filamentli bakterileri içeren Streptomyces ailesinin bir cinsidir ve çok çeşitli sekonder metabolitler üretme yeteneğiyle bilinir. Bu nedenle, biyolojik olarak aktif yeni doğal ürünlerin en önemli kaynaklarından biri olarak kabul edilir. Mevcut çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1 ve S. werraensis ISP 5486'dan izole edilen kumamonamid adı verilen yeni bir bileşik keşfettik. Spektral analiz ve tam spektral analiz kullanılarak kumamonamidin yapısı karakterize edildi ve benzersiz N-alkoksipirol iskeleti belirlendi. sentez. Ursmonoamid ve türevlerinin sentetik bir ara ürünü olan ursmonik asidin, popüler model bitki Arabidopsis thaliana'nın büyümesini ve çimlenmesini engellediği bulundu. Yapı-aktivite ilişkisi üzerine yaptığımız bir çalışmada, ursonik aside modifiye edilmiş C9'lu bir bileşiğin, ursonik asidin noniloksi türevi (KAND) olarak adlandırılan, büyüme ve çimlenme üzerindeki inhibitör etkisini önemli ölçüde artırdığını bulduk. Yeni keşfedilen bitki büyüme inhibitörünün tütün ve ciğer otunun büyümesini de etkilediği ve bakteri veya HeLa hücreleri için sitotoksik olmadığı dikkat çekicidir. Dahası, bazı urmotonik asit türevleri çarpık bir kök fenotipine neden olur; bu da bu türevlerin mikrotübülleri doğrudan veya dolaylı olarak etkilediği anlamına gelir. Bu fikirle tutarlı olarak, immünohistokimyasal olarak veya floresan proteinlerle etiketlenmiş mikrotübüllere ilişkin gözlemlerimiz, KAND uygulamasının mikrotübülleri depolimerize ettiğini göstermektedir. Ayrıca, kumamotonik asit türevleriyle yapılan uygulama aktin mikrofilamentlerini bozmuştur. Dolayısıyla, benzersiz etki mekanizması sitoskeleton yıkımını içeren yeni bir bitki büyüme inhibitörü keşfetmiş olduk.
MK493-CF1 suşu Tokyo, Shinagawa-ku'daki topraktan izole edildi. MK493-CF1 suşu iyi dallanmış stromal miselyum oluşturdu. 16S ribozomal RNA geninin kısmi dizisi (1422 bp) belirlendi. Bu suş, S. werraensis'e çok benzemektedir (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik suş, %99,93). Bu sonuca dayanarak, bu suşun S. werraensis'in tip suşu ile yakın akraba olduğu belirlendi. Bu nedenle, bu suşa geçici olarak S. werraensis MK493-CF1 adını verdik. S. werraensis ISP 5486T de aynı biyoaktif bileşikleri üretir. Bu mikroorganizmadan doğal ürünler elde etmek için erken dönemde çok az araştırma yapıldığından, daha ileri kimyasal araştırmalar yürütülmüştür. S. werraensis MK493-CF1, 30°C'de 14 gün boyunca katı hal fermantasyonu ile arpa besiyerinde yetiştirildikten sonra, besiyeri %50 EtOH ile ekstrakte edildi. 60 ml numune kurutularak 59,5 mg ham ekstrakt elde edildi. Ham ekstrakt, ters faz HPLC'ye tabi tutularak N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, kumamonamid olarak adlandırılır, 36,0 mg) elde edildi. 1'in toplam miktarı, ham ekstraktın yaklaşık %60'ını oluşturmaktadır. Bu nedenle, kumamotoamid 1'in özelliklerini ayrıntılı olarak incelemeye karar verdik.
Coumamonamid 1, beyaz amorf bir tozdur ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRESIMS), C6H8N2O2'yi doğrular (Şekil 1). Bu bileşiğin C2-ikameli pirol parçası, δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH, 1H NMR spektrumunda: 4.5 Hz, H-5) ve δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ile karakterize edilir ve 13C NMR spektrumu dört sp2 karbon atomunun varlığını gösterir. C2 pozisyonunda bir amid grubunun varlığı, C-3 protonundan δC 161.1'deki amid karbonil karbonuna HMBC korelasyonu ile değerlendirildi. Ayrıca, δH 4.10 (3H, S) ve δC 68.3'teki 1 H ve 13 C NMR tepeleri, molekülde N-metoksi gruplarının varlığını göstermektedir. Metoksi grubunun doğru konumu, geliştirilmiş fark spektroskopisi ve nükleer Overhauser kısaltması (NOEDF) gibi spektroskopik analizler kullanılarak henüz belirlenmemiş olsa da, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid ilk aday bileşik olmuştur.
1'in doğru yapısını belirlemek için toplam bir sentez gerçekleştirildi (Şekil 2a). Ticari olarak temin edilebilen 2-aminopiridin 2'nin m-CPBA ile muamelesi, kantitatif verimle karşılık gelen N-oksit 3 ile sonuçlandı. 2'nin 2-aminoazidasyonundan sonra, Abramovich tarafından açıklanan siklokondenzasyon reaksiyonu, istenen 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5'i gram cinsinden elde etmek için 90°C'de benzen içinde gerçekleştirildi. Hız %60 (iki aşama). 15,16. 4'ün metilasyonu ve hidrolizi daha sonra iyi bir verimle (%70, iki aşama) 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik asit ("kumotonik asit" olarak adlandırılır, 6) verdi. Son olarak, sulu amonyak kullanılarak asit klorür ara maddesi 6 ile amidasyon, %98 verimle Kumamoto amidi 1'i verdi. Sentezlenen 1'in tüm spektral verileri izole edilen 1'e benzediğinden 1'in yapısı belirlendi;
Urbenamid ve urbenik asidin biyolojik aktivitesinin genel sentezi ve analizi. (a) Kumamoto amidinin toplam sentezi. (b) Yedi günlük yabani tip Arabidopsis Columbia (Col) fideleri, belirtilen konsantrasyonlarda kumaronamid 6 veya kumaronamid 1 içeren Murashige ve Skoog (MS) plakalarında yetiştirildi. Ölçek çubuğu = 1 cm.
İlk olarak, urbenamid ve ara ürünlerinin bitki büyümesini düzenleme kabiliyetleri açısından biyolojik aktivitelerini değerlendirdik. MS agar besiyerine çeşitli konsantrasyonlarda ursmonamid 1 veya ursmonik asit 6 ekledik ve bu besiyerinde Arabidopsis thaliana fideleri yetiştirdik. Bu analizler, 6'nın yüksek konsantrasyonlarının (500 μM) kök gelişimini engellediğini gösterdi (Şekil 2b). Ardından, 6'nın N1 pozisyonunu değiştirerek çeşitli türevler ürettik ve bunlar üzerinde yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları gerçekleştirdik (analog sentez süreci Destekleyici Bilgiler'de (SI) açıklanmıştır). Arabidopsis fideleri, 50 μM ursonik asit türevleri içeren bir besiyerinde yetiştirildi ve kök uzunlukları ölçüldü. Resimde gösterildiği gibi. Şekil 3a, b ve S1'de gösterildiği gibi, kumamo asitleri N1 pozisyonunda farklı uzunluklarda doğrusal alkoksi zincirlerine (9, 10, 11, 12 ve 13) veya büyük alkoksi zincirlerine (15, 16 ve 17) sahiptir. Türevler kök büyümesini önemli ölçüde engellemiştir. Ayrıca, 200 μM 10, 11 veya 17 uygulamasının çimlenmeyi engellediğini bulduk (Şekil 3c ve S2).
Kumamoto amidinin ve ilgili bileşiklerin yapı-aktivite ilişkisinin incelenmesi. (a) Analogların yapı ve sentez şeması. (b) 50 μM kumaronamid türevleri içeren veya içermeyen MS ortamında yetiştirilen 7 günlük fidelerin kök uzunluğunun ölçümü. Yıldız işaretleri, sahte tedaviyle önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>18. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak gösterilmiştir. nt, tohumların %50'sinden fazlası çimlenmediği için "test edilmedi" anlamına gelir. (c) 200 μM kumaronamid ve ilgili bileşiklerle veya bunlar olmadan MS ortamında 7 gün inkübe edilen işlenmiş tohumların çimlenme oranının nicelleştirilmesi. Yıldız işaretleri, sahte tedaviyle (ki-kare testi) önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. n=96.
İlginç bir şekilde, C9'dan daha uzun alkil yan zincirlerinin eklenmesi inhibitör aktiviteyi azalttı; bu da kumamotoik asitle ilişkili bileşiklerin biyolojik aktivitelerini gösterebilmeleri için belirli bir boyutta yan zincirlere ihtiyaç duyduklarını düşündürmektedir.
Yapı-aktivite ilişkisi analizi, C9'un üronik aside dönüştürüldüğünü ve üronik asidin noniloksi türevinin (bundan sonra KAND 11 olarak anılacaktır) en etkili bitki büyüme inhibitörü olduğunu gösterdiğinden, KAND 11'in daha ayrıntılı bir karakterizasyonunu gerçekleştirdik. Arabidopsis'in 50 μM KAND 11 ile muamele edilmesi çimlenmeyi neredeyse tamamen engelledi, buna karşın daha düşük konsantrasyonlarda (40, 30, 20 veya 10 μM) KAND 11 kök büyümesini doza bağlı bir şekilde engelledi (Şekil 4a, b). KAND 11'in kök meristem canlılığını etkileyip etkilemediğini test etmek için, propidyum iyodür (PI) ile boyanmış kök meristemlerini inceledik ve meristem alan boyutunu ölçtük. 25 μM KAND-11 içeren bir ortamda yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 151,1 ± 32,5 μm iken, DMSO içeren bir kontrol ortamında yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 264,7 ± 30,8 μm idi (Şekil 4c, d), bu da KAND-11'in hücresel aktiviteyi geri kazandırdığını göstermektedir. yayılma. Kök meristemi. Bununla tutarlı olarak, KAND 11 uygulaması kök meristemindeki hücre bölünme belirteci CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyalinin miktarını azalttı (Şekil 4e) 17 . Bu sonuçlar, KAND 11'in hücre çoğalma aktivitesini azaltarak kök büyümesini engellediğini göstermektedir.
Urbenonik asit türevlerinin (urbeniloksi türevleri) büyüme üzerindeki inhibe edici etkisinin analizi. (a) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarıyla MS plakalarında yetiştirilen 7 günlük yabani tip Col fideleri. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Kök uzunluğunun kantifikasyonu. Harfler önemli farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05).n>16. Veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir. (c) 25 μM KAND ile veya 110 μM KAND ile MS plakalarında yetiştirilen propidyum iyodür boyalı doğal tip Col köklerinin konfokal mikroskopisi. Beyaz parantezler kök meristemlerini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (d) Kök meristem boyutunun kantifikasyonu (n = 10 ila 11). İstatistiksel farklılıklar t-testi kullanılarak belirlenmiştir (p< 0,05). Çubuklar ortalama meristem boyutunu temsil eder. (e) CDKB2 yapısını içeren bir kök meristeminin diferansiyel interferans kontrast (DIC) mikroskobu; 1pro: CDKB2; 1-GUS, 25 µM KAND testiyle veya testi olmadan MS plakalarında yetiştirilen 5 günlük fideler üzerinde boyanmış ve boyanmıştır.
KAND 11'in fitotoksisitesi, başka bir dikotiledon bitki olan tütün (Nicotiana tabacum) ve önemli bir kara bitkisi model organizması olan ciğer otu (Marchantia polymorpha) kullanılarak daha ileri testlere tabi tutulmuştur. Arabidopsis örneğinde olduğu gibi, 25 μM KAND 11 içeren ortamda yetiştirilen tütün SR-1 fideleri daha kısa kökler üretmiştir (Şekil 5a). Ayrıca, 48 tohumdan 40'ı 200 μM KAND 11 içeren plakalarda çimlenirken, 48 tohumun tamamı sahte işlem görmüş ortamda çimlenmiştir; bu da daha yüksek KAND konsantrasyonlarının önemli olduğunu göstermektedir (p< 0,05; ki-kare testi) tütünün çimlenmesini engelledi. (Şekil 5b). Ayrıca, ciğer otunda bakteri büyümesini engelleyen KAND 11 konsantrasyonu, Arabidopsis'teki etkili konsantrasyona benzerdi (Şekil 5c). Bu sonuçlar, KAND 11'in çeşitli bitkilerin büyümesini engelleyebileceğini göstermektedir. Daha sonra, ayı monoamidi ile ilişkili bileşiklerin, sırasıyla yüksek hayvan ve bakteri hücrelerinin temsilcileri olan insan HeLa hücreleri ve Escherichia coli suşu DH5α olmak üzere diğer organizmalardaki olası sitotoksisitesini araştırdık. Bir dizi hücre çoğalma deneyinde, kumamonamid 1, kumamonamidik asit 6 ve KAND 11'in 100 μM konsantrasyonlarda HeLa veya E. coli hücrelerinin büyümesini etkilemediğini gözlemledik (Şekil 5d,e).
Arabidopsis dışı organizmalarda KAND 11'in büyüme inhibisyonu. (a) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 25 μM KAND 11 içeren dikey olarak yerleştirilmiş MS plakalarında büyütüldü. (b) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 200 μM KAND 11 içeren yatay olarak yerleştirilmiş MS plakalarında büyütüldü. (c) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarına sahip Gamborg B5 plakalarında büyütülen iki haftalık yabani tip Tak-1 ciğer otu tomurcukları. Kırmızı oklar, iki haftalık inkübasyon süresi içinde büyümesi duran sporları göstermektedir. (d) HeLa hücrelerinin hücre çoğalma testi. Canlı hücre sayısı, hücre sayım kiti 8 (Dojindo) kullanılarak sabit zaman aralıklarında ölçüldü. Kontrol olarak, HeLa hücreleri, RNA polimeraz transkripsiyonunu inhibe eden ve hücre ölümüne neden olan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D) ile muamele edildi. Analizler üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi. (e) E. coli hücre çoğalma testi. E. coli büyümesi, OD600 ölçülerek analiz edildi. Kontrol olarak, hücreler, bakteri hücre duvarı sentezini inhibe eden 50 μg/ml ampisilin (Amp) ile muamele edildi. Analizler üç tekrarlı olarak gerçekleştirildi.
Uramid ile ilişkili bileşiklerin neden olduğu sitotoksisitenin etki mekanizmasını deşifre etmek için, resimde gösterildiği gibi orta düzeyde inhibitör etkiye sahip urbenik asit türevlerini yeniden analiz ettik. Şekil 2b, 6a'da görüldüğü gibi, yüksek konsantrasyonlarda (200 μM) urmotonik asit 6 içeren agar plakalarında yetiştirilen fideler daha kısa ve sola eğimli kökler üretti (θ = – 23,7 ± 6,1), kontrol ortamında yetiştirilen fidelerde ise neredeyse düz kökler üretti (θ = – 3,8 ± 7,1). Bu karakteristik eğik büyümenin, kortikal mikrotübüllerin işlev bozukluğundan kaynaklandığı bilinmektedir14,18. Bu bulguyla tutarlı olarak, mikrotübül dengesizleştirici ilaçlar olan disopiramid ve orizalin, büyüme koşullarımızda benzer kök eğilmesine neden oldu (Şekil 2b, 6a). Aynı zamanda, urmotonik asit türevlerini test ettik ve bunlardan belirli konsantrasyonlarda eğik kök büyümesini indükleyen birkaçını seçtik. Bileşik 8, 9 ve 15, sırasıyla 75 μM, 50 μM ve 40 μM'de kök büyümesinin yönünü değiştirerek bu bileşiklerin mikrotübülleri etkili bir şekilde dengesizleştirebileceğini gösterdi (Şekil 2b, 6a). Ayrıca en güçlü ursolik asit türevi olan KAND 11'i daha düşük bir konsantrasyonda (15 µM) test ettik ve KAND 11 uygulamasının kök büyümesini engellediğini ve kök büyüme yönünün sola doğru eğimli olmalarına rağmen düzensiz olduğunu bulduk (Şekil C3). Mikrotübül dengesizleştirici ilaçların daha yüksek konsantrasyonları bazen kök eğilmesine neden olmak yerine bitki büyümesini engellediğinden, daha sonra KAND 11'in kök epidermal hücrelerindeki kortikal mikrotübülleri gözlemleyerek mikrotübülleri etkileme olasılığını değerlendirdik. 25 μM KAND 11 ile muamele edilen fide köklerinin epidermal hücrelerinde anti-β-tubulin antikorları kullanılarak yapılan immünohistokimya, uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüllerin neredeyse tamamının kaybolduğunu göstermiştir (Şekil 6b). Bu sonuçlar, kumamotonik asit ve türevlerinin mikrotübüller üzerinde doğrudan veya dolaylı olarak etki ederek onları parçaladığını ve bu bileşiklerin yeni mikrotübül inhibitörleri olduğunu göstermektedir.
Ursonik asit ve türevleri, Arabidopsis thaliana'da kortikal mikrotübülleri değiştirir. (a) Belirtilen konsantrasyonlarda çeşitli urmotonik asit türevlerinin varlığında ölçülen kök eğim açısı. Mikrotübülleri inhibe ettiği bilinen iki bileşiğin etkileri de analiz edildi: disopiramid ve orizalin. Ekte, kök büyüme açısını ölçmek için kullanılan standart gösterilmektedir. Yıldız işaretleri, sahte tedaviyle anlamlı farklılıklar olduğunu göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>19. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüller. 25 μM KAND 11 içeren veya içermeyen MS plakalarında yetiştirilen yabani tip Arabidopsis Col köklerindeki mikrotübüller, β-tübülin birincil antikorları ve Alexa Flor konjuge ikincil antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal boyama ile görüntülendi. Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Kök meristemindeki mikrotübüllerin mitotik yapısı. Mikrotübüller immünohistokimyasal boyama kullanılarak görüntülendi. Profaz bölgeleri, iğcikler ve fragmoplastlar dahil olmak üzere mitotik yapılar konfokal görüntülerden sayıldı. Oklar mitotik mikrotübül yapılarını göstermektedir. Yıldız işaretleri, sahte tedaviyle anlamlı farklılıkları göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>9. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Ursa, mikrotübül fonksiyonunu bozma yeteneğine sahip olsa da, etki mekanizmasının tipik mikrotübül depolimerize edici ajanlardan farklı olması beklenmektedir. Örneğin, disopiramid ve orizalin gibi mikrotübül depolimerize edici ajanların daha yüksek konsantrasyonları, epidermal hücrelerin anizotropik genişlemesini indüklerken, KAND 11 bunu yapmaz. Ayrıca, KAND 11 ve disopiramidin birlikte uygulanması, disopiramid kaynaklı birleşik bir kök büyüme tepkisi ile sonuçlanmış ve KAND 11 kaynaklı büyüme inhibisyonu gözlemlenmiştir (Şekil S4). Ayrıca, aşırı duyarlı disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11'e tepkisini de analiz ettik. phs1-1, kanonik olmayan bir tübülin kinaz nokta mutasyonuna sahiptir ve disopiramid ile muamele edildiğinde daha kısa kökler üretir9,20. KAND 11 içeren agar besiyerinde yetiştirilen phs1-1 mutant fideleri, disopiramid üzerinde yetiştirilenlere benzer şekilde daha kısa köklere sahipti (Şekil S5).
Ayrıca, KAND 11 ile muamele edilen fidelerin kök meristeminde profaz bölgeleri, iğ iplikleri ve fragmoplastlar gibi mitotik mikrotübül yapıları gözlemledik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS'taki gözlemlerle tutarlı olarak, mitotik mikrotübül sayısında önemli bir azalma gözlemlendi (Şekil .6c).
KAND 11'in hücre altı çözünürlükte sitotoksisitesini karakterize etmek için tütün BY-2 süspansiyon hücrelerini KAND 11 ile tedavi ettik ve yanıtlarını gözlemledik. İlk olarak, mikrotübülleri floresanla etiketleyen TagRFP-TUA6 ifade eden BY-2 hücrelerine KAND 11 ekleyerek KAND 11'in kortikal mikrotübüller üzerindeki etkisini değerlendirdik. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini ölçen görüntü analizi kullanılarak değerlendirildi. Deney sonuçları, 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile 1 saat tedaviden sonra yoğunluğun sırasıyla %0,94 ± 0,74 veya %0,23 ± 0,28'e önemli ölçüde azaldığını, DMSO ile tedavi edilen hücrelerin yoğunluğunun ise %1,61 ± 0,34'e ulaştığını gösterdi (Şekil 7a). Bu sonuçlar, KAND 11 tedavisinin kortikal mikrotübüllerin depolimerizasyonunu indüklediği Arabidopsis'teki gözlemle tutarlıdır (Şekil 6b). Aynı konsantrasyonda KAND 11 ile tedaviden sonra GFP-ABD ile işaretli aktin filamentleri olan BY-2 hattını da inceledik ve KAND 11 tedavisinin aktin filamentlerini bozduğunu gözlemledik. 1 saat boyunca 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile tedavi, aktin filament yoğunluğunu sırasıyla %1,20 ± 0,62 veya %0,61 ± 0,26'ya önemli ölçüde düşürürken, DMSO ile tedavi edilen hücrelerdeki yoğunluk %1,69 ± 0,51 idi (Şekil 2). 7b). Bu sonuçlar, aktin filamentlerini etkilemeyen propizamidin ve mikrotübülleri etkilemeyen bir aktin depolimerizatörü olan latrunculin B'nin etkileriyle çelişmektedir (SI Şekil S6). Ek olarak, kumaronamid 1, kumaronamid asit 6 veya KAND 11 ile tedavi, HeLa hücrelerindeki mikrotübülleri etkilememiştir (SI Şekil S7). Bu nedenle, KAND 11'in etki mekanizmasının bilinen sitoskeletal bozuculardan farklı olduğuna inanılmaktadır. Ek olarak, KAND 11 ile tedavi edilen BY-2 hücrelerine ilişkin mikroskobik gözlemlerimiz, KAND 11 tedavisi sırasında hücre ölümünün başladığını ortaya koymuş ve Evans mavisi ile boyanmış ölü hücre oranının 30 dakikalık KAND 11 tedavisinden sonra önemli ölçüde artmadığını, buna karşın 50 μM veya 100 μM KAND ile 90 dakikalık tedaviden sonra ölü hücre sayısının sırasıyla %43,7 veya %80,1'e yükseldiğini göstermiştir (Şekil 7c). Birlikte ele alındığında, bu veriler yeni ursolik asit türevi KAND 11'in daha önce bilinmeyen bir etki mekanizmasına sahip bitkiye özgü bir sitoskeletal inhibitör olduğunu göstermektedir.
KAND, kortikal mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve tütün BY-2 hücrelerinin canlılığını etkiler. (a) TagRFP-TUA6 varlığında BY-2 hücrelerinde kortikal mikrotübüllerin görüntülenmesi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile tedavi edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler anlamlı farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (b) GFP-ABD2 varlığında görüntülenen BY-2 hücrelerindeki kortikal aktin filamentleri. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile tedavi edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal aktin filamentlerinin yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler anlamlı farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Evans mavisi boyama ile ölü BY-2 hücrelerinin gözlemlenmesi. KAND 11 (50 µM veya 100 µM) veya DMSO ile muamele edilen BY-2 hücreleri parlak alan mikroskobu ile incelendi. n = 3. Ölçek çubuğu = 100 µm.
Yeni doğal ürünlerin keşfi ve uygulanması, tıp ve tarım da dahil olmak üzere insan yaşamının çeşitli yönlerinde önemli ilerlemelere yol açmıştır. Doğal kaynaklardan faydalı bileşikler elde etmek için tarihsel araştırmalar yapılmıştır. Özellikle aktinomisetlerin, ivermektinin ve bleomisin ve türevlerinin başlıca bileşiği olan avermektin gibi çeşitli sekonder metabolitleri üretme kabiliyetleri nedeniyle nematodlar için antiparazitik antibiyotikler olarak faydalı oldukları bilinmektedir ve bunlar tıbbi olarak kanser karşıtı bir ajan olarak kullanılır21,22. Benzer şekilde, aktinomisetlerden çeşitli herbisit bileşikleri keşfedilmiştir ve bunlardan bazıları halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır1,23. Bu nedenle, istenen biyolojik aktivitelere sahip doğal ürünleri izole etmek için aktinomiset metabolitlerinin analizi etkili bir strateji olarak kabul edilir. Bu çalışmada, S. werraensis'ten yeni bir bileşik olan kumamonamidi keşfettik ve başarıyla sentezledik. Ursonik asit, urbenamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesidir. Karakteristik kök kıvrılmasına neden olabilir, orta ila güçlü herbisit aktivitesi gösterebilir ve bitki mikrotübüllerine doğrudan veya dolaylı olarak zarar verebilir. Ancak, urmotonik asidin etki mekanizması mevcut mikrotübül inhibitörlerinden farklı olabilir, çünkü KAND 11 aynı zamanda aktin filamentlerini bozarak hücre ölümüne neden olur ve bu da urmotonik asit ve türevlerinin çok çeşitli sitoskeletal yapıları etkilediği düzenleyici bir mekanizma olduğunu düşündürmektedir.
Ursonik asidin daha detaylı karakterizasyonu, ursonik asidin etki mekanizmasını daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Özellikle, bir sonraki hedef, ursonik asidin indirgenmiş mikrotübüllere bağlanma yeteneğini değerlendirerek ursonik asit ve türevlerinin mikrotübüller üzerinde doğrudan etki edip depolimerize edip etmediğini veya etkilerinin mikrotübül destabilizasyonuna yol açıp açmadığını belirlemektir. Ek olarak, mikrotübüllerin doğrudan hedef olmadığı durumlarda, ursonik asidin bitki hücreleri üzerindeki etki yerini ve moleküler hedeflerini belirlemek, ilgili bileşiklerin özelliklerini ve herbisit etkinliğini artırmanın olası yollarını daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Biyoaktivite testimiz, ursonik asidin Arabidopsis thaliana, tütün ve ciğer otu gibi bitkilerin büyümesi üzerindeki benzersiz sitotoksik yeteneğini ortaya koyarken, ne E. coli ne de HeLa hücreleri etkilenmemiştir. Hayvan hücreleri için çok az veya hiç toksisite göstermemesi, ursonik asit türevlerinin açık tarım alanlarında kullanılmak üzere herbisit olarak geliştirilmeleri durumunda bir avantajıdır. Gerçekten de, mikrotübüller ökaryotlarda yaygın yapılar olduğundan, bitkilerde seçici inhibisyonları herbisitler için temel bir gerekliliktir. Örneğin, doğrudan tübüline bağlanan ve polimerizasyonu inhibe eden bir mikrotübül depolimerizatörü olan propizamid, hayvan hücreleri için düşük toksisitesi nedeniyle bir herbisit olarak kullanılır24. Disopiramidin aksine, ilgili benzamidler farklı hedef özgüllüklerine sahiptir. Bitki mikrotübüllerine ek olarak, RH-4032 veya benzoksamid de sırasıyla hayvan hücrelerinin veya oomisitlerin mikrotübüllerini inhibe eder ve zalilamid düşük fitotoksisitesi nedeniyle bir fungisit olarak kullanılır25,26,27. Yeni keşfedilen ayı ve türevleri bitkilere karşı seçici sitotoksisite gösterir, ancak daha fazla modifikasyonun hedef özgüllüğünü değiştirebileceğini ve potansiyel olarak patojenik mantarların veya oomisitlerin kontrolü için ek türevler sağlayabileceğini belirtmekte fayda vardır.
Urbenonik asit ve türevlerinin benzersiz özellikleri, herbisit olarak geliştirilmeleri ve araştırma araçları olarak kullanılmaları için faydalıdır. Bitki hücre şeklinin kontrolünde sitoskeletonun önemi yaygın olarak kabul edilmektedir. Daha önceki çalışmalar, bitkilerin morfogenezi uygun şekilde kontrol etmek için mikrotübül dinamiklerini kontrol ederek kortikal mikrotübül organizasyonunun karmaşık mekanizmalarını geliştirdiğini göstermiştir. Mikrotübül aktivitesinin düzenlenmesinden sorumlu çok sayıda molekül tanımlanmıştır ve ilgili araştırmalar halen devam etmektedir3,4,28. Bitki hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerine ilişkin mevcut anlayışımız, kortikal mikrotübül organizasyonunun mekanizmalarını tam olarak açıklamamaktadır. Örneğin, hem disopiramid hem de orizalin mikrotübülleri depolimerize edebilmesine rağmen, disopiramid ciddi kök bozulmasına neden olurken orizalin nispeten hafif bir etkiye sahiptir. Dahası, mikrotübülleri stabilize eden tubulindeki mutasyonlar da köklerde dekstrorotasyona neden olurken, mikrotübül dinamiklerini de stabilize eden paklitaksel neden olmaz. Bu nedenle, ursolik asidin moleküler hedeflerinin incelenmesi ve belirlenmesi, bitki korteks mikrotübüllerinin düzenlenmesine yeni bakış açıları sağlayacaktır. Benzer şekilde, disopiramid gibi çarpık büyümeyi teşvik etmede etkili olan kimyasallar ile orizalin veya kumamotorik asit gibi daha az etkili kimyasalların gelecekte karşılaştırılması, çarpık büyümenin nasıl meydana geldiğine dair ipuçları sağlayacaktır.
Öte yandan, savunmayla ilişkili sitoskeletal yeniden düzenlemeler, ursonik asidin sitotoksisitesini açıklamak için başka bir olasılıktır. Bir patojenin enfeksiyonu veya bir uyarıcının bitki hücrelerine sokulması bazen sitoskeletonun yıkımına ve ardından hücre ölümüne neden olur29. Örneğin, oomisit türevi kriptoksantinin, KAND tedavisinde olduğu gibi, tütün hücre ölümünden önce mikrotübülleri ve aktin filamentlerini bozduğu bildirilmiştir30,31. Ursonik asit tarafından indüklenen savunma tepkileri ve hücresel tepkiler arasındaki benzerlikler, ursonik asidin kriptoksantinden daha hızlı ve daha güçlü bir etkisi olduğu açık olsa da, bunların ortak hücresel süreçleri tetiklediği hipotezini öne sürmemize yol açtı. Bununla birlikte, çalışmalar aktin filamentlerinin bozulmasının, her zaman mikrotübül bozulmasıyla birlikte olmayan kendiliğinden hücre ölümünü teşvik ettiğini göstermiştir29. Ayrıca, patojenin veya uyarıcının, ursonik asit türevlerinin yaptığı gibi, çarpık kök büyümesine neden olup olmadığı henüz görülmemiştir. Bu nedenle, savunma tepkilerini ve sitoskeletonu birbirine bağlayan moleküler bilgi, ele alınması gereken cazip bir sorundur. Ursonik asitle ilişkili düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin ve çeşitli potansiyellere sahip türevlerin varlığından yararlanılarak, bilinmeyen hücresel mekanizmaları hedefleme fırsatları sağlanabilir.
Mikrotübül dinamiklerini düzenleyen yeni bileşiklerin keşfi ve uygulanması, bitki hücresi şeklinin belirlenmesinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmaları ele almak için güçlü yöntemler sağlayacaktır. Bu bağlamda, mikrotübülleri ve aktin filamentlerini etkileyen ve hücre ölümüne neden olan yeni geliştirilen urmotonik asit bileşiği, mikrotübül kontrolü ile bu diğer mekanizmalar arasındaki bağlantıyı çözme fırsatı sunabilir. Dolayısıyla, urmotonik asit kullanılarak yapılan kimyasal ve biyolojik analizler, bitki hücre iskeletini kontrol eden moleküler düzenleyici mekanizmaları anlamamıza yardımcı olacaktır.
S. werraensis MK493-CF1'i, %2 (a/h) galaktoz, %2 (a/h) Esans ezmesi ve %1 (a/h) Bacto bileşiminden oluşan 110 mL tohum ortamı içeren 500 mL bölmeli bir Erlenmeyer şişesine aşılayın. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), %0,5 (a/h) mısır özü (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), %0,2 (a/h) (NH4)2SO4 ve %0,2 CaCO3 içeren deiyonize su karışımını ekleyin. (Sterilizasyondan önce pH 7,4 olmalıdır). Tohum kültürleri, 27°C'de döner bir çalkalayıcıda (180 rpm) 2 gün inkübe edildi. Üretim, katı hal fermantasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Tohum kültürü (7 ml), 15 g preslenmiş arpa (MUSO Co., Ltd., Japonya) ve 25 g deiyonize sudan (sterilizasyondan önce pH ayarlanmamış) oluşan 40 g üretim ortamı içeren 500 ml'lik bir K-1 şişesine aktarıldı. Fermantasyon, karanlıkta 30°C'de 14 gün boyunca gerçekleştirildi. Fermantasyon materyali, 40 ml/şişe EtOH ile ekstrakte edildi ve santrifüj edildi (1500 g, 4°C, 10 dakika). Kültür süpernatantı (60 ml), %10 MeOH/EtOAc karışımı ile ekstrakte edildi. Organik katman, bir kalıntı (59,5 mg) elde etmek için azaltılmış basınç altında buharlaştırıldı ve bu kalıntı, ters faz kolonunda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × uzunluk 250 mm) gradyan elüsyonu (0-10 dakika: %90) ile HPLC'ye tabi tutuldu. H2O/CH3CN, 10-35 dakika: %90 H2O/CH3CN ila %70 H2O/CH3CN (gradyan), 35-45 dakika: %90 H2O/EtOH, 45-155 dakika: %90 H2O/EtOH ila %100 EtOH (gradyan (gradyan), 155-200 dakika: %100 EtOH) 1,5 ml/dakika akış hızında, kumamonamid (1, 36,0 mg) beyaz amorf bir toz olarak izole edildi.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesaplanan değer: 141.0659, ölçülen değer: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia tohumları (Col-0) araştırma amaçlı kullanım için izin alınarak Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi'nden (ABRC) temin edildi. Col-0 tohumları laboratuvar koşullarımızda çoğaltıldı ve muhafaza edildi ve yabani tip Arabidopsis bitkileri olarak kullanıldı. Arabidopsis tohumları yüzey sterilizasyonuna tabi tutuldu ve %2 sukroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), %0,05 (a/h) 2-(4-morfolino)etansülfonik asit (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü Murashige ve Skoog besiyerinde kültüre alındı. ) ve %1,5 agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C'de ve sabit ışıkta. phs1-1 mutantının tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı.
SR-1 suşunun tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı ve yabani tip tütün bitkisi olarak kullanıldı. Tütün tohumları yüzey sterilizasyonuna tabi tutuldu ve çimlenmeyi teşvik etmek için üç gece boyunca steril suda bekletildi. Ardından, %2 sakaroz, %0,05 (a/h) MES ve %0,8 gellan zamkı (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü bir çözeltiye (Murashige ve Skoog besiyeri) pH 5,7'ye yerleştirildi ve 23°C'de sabit ışık altında inkübe edildi.
Tak-1 suşu, T. Kohchi (Kyoto Üniversitesi) tarafından sağlanmış ve ciğer otu çalışması için standart deneysel birim olarak kullanılmıştır. Gemma, sterilize edilmiş kültür bitkilerinden elde edilmiş ve ardından %1 sakaroz ve %0,3 jellan zamkı içeren Gamborg B5 besiyerine (Fujifilm Wako Pure Chemical) ekilmiş ve 23°C'de sürekli ışık altında inkübe edilmiştir.
Tütün BY-2 hücreleri (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlandı. BY-2 hücreleri modifiye Linsmeier ve Skoog ortamında 95 kat seyreltildi ve haftalık olarak 2,4-diklorofenoksiasetik asit 32 ile desteklendi. Hücre süspansiyonu karanlıkta 27°C'de 130 rpm'de döner bir çalkalayıcıda karıştırıldı. Hücreleri taze ortamın hacminin 10 katı hacimde yıkayın ve aynı ortamda tekrar süspanse edin. Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü altında mikrotübül işaretleyicisi TagRFP-TUA6 veya aktin filament işaretleyicisi GFP-ABD2'yi stabil şekilde ifade eden BY-2 transgenik hücre hatları açıklandığı gibi üretildi33,34,35. Bu hücre hatları, orijinal BY-2 hücre hattı için kullanılanlara benzer prosedürler kullanılarak korunabilir ve senkronize edilebilir.
HeLa hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 1,2 U/ml penisilin ve 1,2 μg/ml streptomisin eklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) (Life Technologies) %5 CO2 içeren 37°C'lik bir inkübatörde kültüre edildi.
Bu yazıda anlatılan tüm deneyler Japon biyogüvenlik yönetmeliklerine ve yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Bileşikler stok çözeltiler olarak dimetil sülfoksit (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) içinde çözüldü ve Arabidopsis ve tütün için MS besiyerinde veya ciğer otu için Gamborg B5 besiyerinde seyreltildi. Kök büyüme inhibisyonu testi için, plaka başına 10'dan fazla tohum belirtilen bileşikleri veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Tohumlar 7 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi. Fideler fotoğraflandı ve köklerin uzunluğu ölçüldü. Arabidopsis çimlenme testi için, plaka başına 48 tohum 200 μM bileşik veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Arabidopsis tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve çimlenen fide sayısı çimlenmeden 7 gün sonra (dag) sayıldı. Tütün çimlenme testi için, plaka başına 24 tohum 200 μM KAND veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Tütün tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve çimlenen fide sayısı 14 gün sonra sayıldı. Karaciğer otu büyüme inhibisyon testi için her plakadan 9 embriyo, belirtilen konsantrasyonlarda KAND veya DMSO içeren agar ortamına ekildi ve 14 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi.
Kök meristem organizasyonunu görselleştirmek için 5 mg/ml propidyum iyodür (PI) ile boyanmış fideler kullanın. PI sinyalleri, TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak floresan mikroskobu ile gözlendi.
Köklerin β-glukuronidaz (GUS) ile histokimyasal boyaması, Malami ve Benfey36 tarafından açıklanan protokole göre gerçekleştirildi. Fideler, %90'lık asetonda bir gece fiksasyona tabi tutuldu, 1 saat boyunca GUS tamponunda 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik asit ile boyandı ve hidratlı bir kloraldehit çözeltisine yerleştirildi. (8 g kloral hidrat, 2 ml su ve 1 ml gliserol) ve Axio Imager M1 mikroskobu (Carl Zeiss) kullanılarak diferansiyel interferans kontrast mikroskobu ile gözlendi.
Dikey olarak yerleştirilmiş plakalarda yetiştirilen 7 günlük fidelerde kök açıları ölçüldü. Kök açısını, 6. adımda açıklandığı gibi yerçekimi vektörü yönünden ölçün.
Kortikal mikrotübüllerin dizilimi, protokolde küçük değişiklikler yapılarak açıklandığı gibi gözlendi 37. Birincil ve ikincil antikor olarak sırasıyla 1:1000 ve 1:100 seyreltme oranlarında anti-β-tübülin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ve Alexa Fluor 488-konjuge anti-fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) kullanıldı. Floresan görüntüleri, bir TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak elde edildi. Üreticinin talimatlarına göre Z-yığın görüntüleri elde edin ve maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.
HeLa hücre proliferasyon testi, üreticinin talimatlarına göre Hücre Sayım Kiti 8 (Dojindo) kullanılarak gerçekleştirildi.
E. coli DH5α'nın büyümesi, 600 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak kültürdeki hücre yoğunluğunun ölçülmesiyle analiz edildi (OD600).
Transgenik BY-2 hücrelerindeki sitoskeletal organizasyon, CSU-X1 konfokal tarama cihazı (Yokogawa) ve sCMOS kamera (Zyla, Andor Technology) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlendi. Sitoiskelet yoğunluğu, ImageJ yazılımı kullanılarak konfokal görüntülerdeki sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini belirleyen görüntü analizi ile değerlendirildi38,39.
BY-2 hücrelerinde hücre ölümünü tespit etmek için, hücre süspansiyonunun bir kısmı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,05 Evans mavisi ile inkübe edildi. Ölü hücrelerin seçici Evans mavisi boyaması, boyanın sağlam plazma membranı tarafından canlı hücrelerden atılmasına bağlıdır40. Boyanan hücreler, parlak alan mikroskobu (BX53, Olympus) kullanılarak incelendi.
HeLa hücreleri, 37°C ve %5 CO2'de nemli bir inkübatörde %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldü. Hücreler, 37°C'de 6 saat boyunca 100 μM KAND 11, kumamonamik asit 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) veya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ile muamele edildi. Hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika MetOH ile ve ardından 5 dakika asetat ile fiksasyona tabi tutuldu. Fikse edilen hücreler, %0,5 BSA/PBS'de seyreltilmiş β-tubulin primer antikoru (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ile 2 saat inkübe edildi, 3 kez TBST ile yıkandı ve ardından Alexa Flor keçi antikoru ile inkübe edildi. 488 1 saat. – Fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ve 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), %0,5 BSA/PBS'de seyreltildi. Üç kez TBST ile yıkandıktan sonra, boyanmış hücreler Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopta incelendi. Görüntüler, soğutulmuş bir Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera ile MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak alındı.
Gönderi zamanı: 17 Haz 2024