Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi sonuçlar için, tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stil veya JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Doğal ürünlerin keşfi ve faydalı kullanımı insan yaşamını iyileştirmeye yardımcı olabilir. Bitki büyümesini engelleyici kimyasallar, yabancı otları kontrol etmek için yaygın olarak herbisit olarak kullanılmaktadır. Farklı herbisit türlerinin kullanılması gerekliliği nedeniyle, yeni etki mekanizmalarına sahip bileşiklerin belirlenmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1'den yeni bir N-alkoksipirrol bileşiği olan kumaronamidi keşfettik ve tam sentez sürecini oluşturduk. Biyolojik aktivite testleri yoluyla, urs-monoamik asidin urs-monoamidin sentetik bir ara maddesi ve potansiyel bir bileşik olduğunu keşfettik.bitki büyüme inhibitörüAyrıca, HeLa hücrelerinin büyümesini olumsuz etkilemeden yüksek herbisit aktivitesine sahip olan urbeniloksi türevi (UDA) de dahil olmak üzere çeşitli urbenonik asit türevleri geliştirdik. Ayrıca, urmotonik asit türevlerinin bitki mikrotübüllerini bozduğunu; ek olarak, KAND'ın aktin filamentlerini etkilediğini ve hücre ölümüne neden olduğunu bulduk. Bu çok yönlü etkiler, bilinen mikrotübül inhibitörlerinden farklıdır ve ursonik asit için yeni bir etki mekanizması önermektedir; bu da yeni herbisitlerin geliştirilmesinde önemli bir avantaj sağlamaktadır.
Faydalı doğal ürünlerin ve türevlerinin keşfi ve pratik uygulaması, insan yaşam kalitesini iyileştirmenin bir yoludur. Mikroorganizmalar, bitkiler ve böcekler tarafından üretilen ikincil metabolitler, tıp ve tarımda büyük ilerlemelere yol açmıştır. Birçok antibiyotik ve lösemi karşıtı ilaç doğal ürünlerden geliştirilmiştir. Ayrıca, çeşitli türlerdeböcek ilaçlarıBu doğal ürünlerden tarımda kullanılmak üzere fungisitler ve herbisitler elde edilir. Özellikle yabancı ot kontrolü için kullanılan herbisitler, modern tarımda ürün verimini artırmak için önemli araçlardır ve çeşitli bileşik türleri halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır. Bitkilerdeki fotosentez, amino asit metabolizması, hücre duvarı sentezi, mitoz düzenlemesi, fitohormon sinyallemesi veya protein sentezi gibi çeşitli hücresel süreçler, herbisitlerin tipik hedefleri olarak kabul edilir. Mikrotübül fonksiyonunu inhibe eden bileşikler, mitoz düzenlemesini etkileyerek bitki büyümesini etkileyen yaygın bir herbisit sınıfıdır.
Mikrotübüller, sitoskeletin bileşenleridir ve ökaryotik hücrelerde yaygın olarak korunmuştur. Tübülin heterodimeri, α-tübülin ve β-tübülinden oluşan doğrusal mikrotübül protofilamentlerinden oluşur ve 13 protofilament silindirik bir yapı oluşturur. Mikrotübüller, bitki hücrelerinde hücre şeklinin belirlenmesi, hücre bölünmesi ve hücre içi taşıma dahil olmak üzere birçok rol oynar3,4. Bitki hücreleri, interfaz plazma zarının altında mikrotübüller içerir ve bu sözde kortikal mikrotübüllerin, selüloz sentaz komplekslerinin düzenlenmesi yoluyla selüloz mikrofibrillerinin organizasyonunu kontrol ettiği düşünülmektedir4,5. Kök ucunun hızlı uzama bölgesinde bulunan kök epidermal hücrelerinin kortikal mikrotübülleri yanal olarak yerleşmiştir ve selüloz mikrofiberleri bu mikrotübülleri takip ederek hücre genişlemesinin yönünü sınırlar ve böylece anizotropik hücre uzamasını teşvik eder. Bu nedenle, mikrotübül fonksiyonu bitki morfolojisiyle yakından ilişkilidir. Tubulin kodlayan genlerdeki amino asit değişimleri, Arabidopsis'te kortikal mikrotübül dizilerinin çarpıklığına ve sol veya sağ taraflı büyümeye neden olur 6,7. Benzer şekilde, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen mikrotübül ilişkili proteinlerdeki mutasyonlar da bozulmuş kök büyümesine yol açabilir 8,9,10,11,12,13. Ayrıca, pretilachlor olarak da bilinen disopiramid gibi mikrotübül bozucu herbisitlerle yapılan tedavi de sol taraflı eğik kök büyümesine neden olur 14. Bu veriler, mikrotübül fonksiyonunun hassas düzenlenmesinin bitki büyümesinin yönünü belirlemede kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.
Çeşitli mikrotübül inhibitörleri keşfedilmiş ve bu ilaçlar sitoskeletal araştırmalara, tarıma ve tıbba önemli katkılarda bulunmuştur². Özellikle oryzalin, dinitroanilin bileşikleri, disopiramid, benzamid ile ilgili bileşikler ve bunların analogları mikrotübül fonksiyonunu inhibe ederek bitki büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, yaygın olarak herbisit olarak kullanılırlar. Bununla birlikte, mikrotübüller bitki ve hayvan hücrelerinin önemli bir bileşeni olduğundan, çoğu mikrotübül inhibitörü her iki hücre tipi için de sitotoksiktir. Bu nedenle, herbisit olarak bilinen faydalarına rağmen, sınırlı sayıda antimikrotübül ajanı pratik amaçlar için kullanılmaktadır.
Streptomyces, aerobik, gram-pozitif, filamentli bakterileri içeren ve çok çeşitli ikincil metabolitler üretme yeteneğiyle bilinen Streptomyces familyasının bir cinsidir. Bu nedenle, yeni biyolojik olarak aktif doğal ürünlerin en önemli kaynaklarından biri olarak kabul edilir. Bu çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1 ve S. werraensis ISP 5486'dan izole edilen kumarinamid adı verilen yeni bir bileşik keşfettik. Spektral analiz ve tam spektral analiz kullanılarak, kumarinamidin yapısı karakterize edildi ve benzersiz N-alkoksipirrol iskeleti belirlendi. Ursmonoamidin ve türevlerinin sentetik bir ara maddesi olan ursmonik asidin, popüler model bitki Arabidopsis thaliana'nın büyümesini ve çimlenmesini inhibe ettiği bulundu. Yapı-aktivite ilişkisi çalışmasında, ursonik asidin noniloksi türevi (KAND) olarak adlandırılan, C9'u ursonik aside modifiye edilmiş bir bileşiğin, büyüme ve çimlenmeyi engelleyici etkisini önemli ölçüde artırdığını bulduk. Özellikle, yeni keşfedilen bitki büyüme inhibitörü, tütün ve karaciğer otunun büyümesini de etkiledi ve bakteri veya HeLa hücreleri için sitotoksik değildi. Dahası, bazı ursonik asit türevleri, bozulmuş bir kök fenotipi indükleyerek, bu türevlerin doğrudan veya dolaylı olarak mikrotübülleri etkilediğini ima etmektedir. Bu fikirle tutarlı olarak, immünohistokimyasal olarak veya floresan proteinlerle etiketlenmiş mikrotübüller üzerindeki gözlemlerimiz, KAND tedavisinin mikrotübülleri depolimerize ettiğini göstermektedir. Ek olarak, kumamotonik asit türevleriyle yapılan tedavi, aktin mikrofilamentlerini bozmuştur. Böylece, benzersiz etki mekanizması sitoskeletin yıkımını içeren yeni bir bitki büyüme inhibitörü keşfettik.
MK493-CF1 suşu, Tokyo'nun Shinagawa-ku bölgesindeki topraktan izole edilmiştir. MK493-CF1 suşu, iyi dallanmış stromal miselyum oluşturmuştur. 16S ribozomal RNA geninin kısmi dizisi (1422 bp) belirlenmiştir. Bu suş, S. werraensis'e (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik suş, %99,93) çok benzerdir. Bu sonuca dayanarak, bu suşun S. werraensis'in tip suşuyla yakından ilişkili olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle, bu suşa geçici olarak S. werraensis MK493-CF1 adını verdik. S. werraensis ISP 5486T de aynı biyoaktif bileşikleri üretmektedir. Bu mikroorganizmadan doğal ürünler elde etmeye yönelik erken dönem araştırmaları az olduğundan, daha ileri kimyasal araştırmalar yapılmıştır. S. werraensis MK493-CF1'in 30°C'de 14 gün boyunca katı hal fermantasyonu ile arpa ortamında kültivasyonundan sonra, ortam %50 EtOH ile ekstrakte edildi. 60 ml numune kurutularak 59,5 mg ham ekstrakt elde edildi. Ham ekstrakt, ters fazlı HPLC'ye tabi tutularak N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, kumamonamid olarak adlandırıldı, 36,0 mg) elde edildi. 1'in toplam miktarı, ham ekstraktın yaklaşık %60'ıdır. Bu nedenle, kumamonamid 1'in özelliklerini ayrıntılı olarak incelemeye karar verdik.
Kumamonamid 1, beyaz amorf bir tozdur ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRESIMS) C6H8N2O2 olduğunu doğrular (Şekil 1). Bu bileşiğin C2-sübstite pirol parçası, δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR spektrumunda δH: 4.5 Hz, H-5) ve δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ile karakterize edilir ve 13C NMR spektrumu dört sp2 karbon atomunun varlığını gösterir. C2 pozisyonunda bir amid grubunun varlığı, C-3 protonundan δC 161.1'deki amid karbonil karbonuna HMBC korelasyonu ile değerlendirilmiştir. Ek olarak, δH 4.10 (3H, S) ve δC 68.3'teki 1H ve 13C NMR pikleri, molekülde N-metoksi gruplarının varlığını göstermektedir. Metoksi grubunun doğru pozisyonu, gelişmiş fark spektroskopisi ve nükleer Overhauser kısaltması (NOEDF) gibi spektroskopik analizler kullanılarak henüz belirlenmemiş olsa da, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid ilk aday bileşik olmuştur.
1'in doğru yapısını belirlemek için toplam bir sentez gerçekleştirildi (Şekil 2a). Ticari olarak temin edilebilen 2-aminopiridin 2'nin m-CPBA ile işlenmesi, karşılık gelen N-oksit 3'ü kantitatif verimle verdi. 2'nin 2-aminoazidasyonundan sonra, Abramovich tarafından tanımlanan siklokondensasyon reaksiyonu, istenen 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5'i gram olarak elde etmek için 90°C'de benzen içinde gerçekleştirildi. Verim %60 (iki aşama). 15,16. Daha sonra 4'ün metilasyonu ve hidrolizi, iyi bir verimle (%70, iki aşama) 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik asit ( "kumotonik asit" olarak adlandırılır, 6) verdi. Son olarak, sulu amonyak kullanılarak asit klorür ara ürünü 6 üzerinden amidasyon, %98 verimle Kumamoto amid 1'i verdi. Sentezlenen 1'in tüm spektral verileri izole edilen 1'e benzerdi, bu nedenle 1'in yapısı belirlendi;
Urbenamid ve urbenik asidin biyolojik aktivitesinin genel sentezi ve analizi. (a) Kumamoto amidin toplam sentezi. (b) Yedi günlük yabani tip Arabidopsis Columbia (Col) fideleri, belirtilen konsantrasyonlarda kumarinamid 6 veya kumarinamid 1 içeren Murashige ve Skoog (MS) plakalarında yetiştirildi. Ölçek çubuğu = 1 cm.
İlk olarak, urbenamidin ve ara ürünlerinin bitki büyümesini düzenleme yetenekleri açısından biyolojik aktivitelerini değerlendirdik. MS agar ortamına çeşitli konsantrasyonlarda ursmonamid 1 veya ursmonik asit 6 ekledik ve bu ortamda Arabidopsis thaliana fidelerini yetiştirdik. Bu deneyler, 6'nın yüksek konsantrasyonlarının (500 μM) kök büyümesini engellediğini gösterdi (Şekil 2b). Daha sonra, 6'nın N1 pozisyonuna ikame ederek çeşitli türevler ürettik ve bunlar üzerinde yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları gerçekleştirdik (analog sentez süreci Destekleyici Bilgilerde (SI) açıklanmıştır). Arabidopsis fideleri, 50 μM ursonik asit türevleri içeren bir ortamda yetiştirildi ve kök uzunluğu resimde gösterildiği gibi ölçüldü. Şekil 3a, b ve S1'de gösterildiği gibi, kumaro asitler N1 pozisyonunda farklı uzunluklarda doğrusal alkoksi zincirlerine (9, 10, 11, 12 ve 13) veya büyük alkoksi zincirlerine (15, 16 ve 17) sahiptir. Türevler kök büyümesini önemli ölçüde engelledi. Ek olarak, 200 μM 10, 11 veya 17 uygulamasının çimlenmeyi engellediğini bulduk (Şekil 3c ve S2).
Kumamoto amid ve ilgili bileşiklerin yapı-aktivite ilişkisinin incelenmesi. (a) Analogların yapısı ve sentez şeması. (b) 50 μM kumaronamid türevleri ile veya türevleri olmadan MS ortamında yetiştirilen 7 günlük fidelerin kök uzunluğunun ölçümü. Yıldız işaretleri, kontrol grubuyla anlamlı farklılıkları göstermektedir (t testi, p < 0.05).< 0.05). n>18. Veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir. nt, tohumların %50'sinden fazlasının çimlenmediği anlamına gelir ve "test edilmedi" demektir. (c) 200 μM kumarinamid ve ilgili bileşiklerle veya bunlar olmadan MS ortamında 7 gün inkübe edilen işlem görmüş tohumların çimlenme oranının nicel değerlendirmesi. Yıldız işaretleri, kontrol grubuyla anlamlı farklılıkları göstermektedir (ki-kare testi). n=96.
İlginç bir şekilde, C9'dan daha uzun alkil yan zincirlerinin eklenmesi inhibitör aktiviteyi azalttı; bu da kumamotoik asit ile ilgili bileşiklerin biyolojik aktivitelerini gösterebilmeleri için belirli bir boyutta yan zincirlere ihtiyaç duyduklarını düşündürmektedir.
Yapı-aktivite ilişkisi analizi, C9'un ursonik aside dönüştürüldüğünü ve ursonik asidin noniloksi türevinin (bundan sonra KAND 11 olarak anılacaktır) en etkili bitki büyüme inhibitörü olduğunu gösterdiğinden, KAND 11'in daha ayrıntılı bir karakterizasyonunu gerçekleştirdik. Arabidopsis'in 50 μM KAND 11 ile muamele edilmesi çimlenmeyi neredeyse tamamen engelledi, oysa daha düşük konsantrasyonlardaki (40, 30, 20 veya 10 μM) KAND 11, kök büyümesini doza bağlı bir şekilde inhibe etti (Şekil 4a, b). KAND 11'in kök meristem canlılığını etkileyip etkilemediğini test etmek için, propidium iyodür (PI) ile boyanmış kök meristemlerini inceledik ve meristem alan büyüklüğünü ölçtük. 25 μM KAND-11 içeren bir ortamda yetiştirilen fidelerin meristeminin boyutu 151,1 ± 32,5 μm iken, DMSO içeren kontrol ortamında yetiştirilen fidelerin meristeminin boyutu 264,7 ± 30,8 μm idi (Şekil 4c, d). Bu, KAND-11'in hücresel aktiviteyi geri kazandırdığını göstermektedir. Kök meristemi. Buna paralel olarak, KAND 11 uygulaması, kök meristemindeki hücre bölünmesi belirteci CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyalinin miktarını azalttı (Şekil 4e) 17. Bu sonuçlar, KAND 11'in hücre çoğalma aktivitesini azaltarak kök büyümesini engellediğini göstermektedir.
Urbenonik asit türevlerinin (urbeniloksi türevleri) büyüme üzerindeki engelleyici etkisinin analizi. (a) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarında MS plakalarında yetiştirilen 7 günlük yabani tip Col fideleri. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Kök uzunluğunun ölçümü. Harfler anlamlı farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p < 0.05).< 0.05). n>16. Veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir. (c) 25 μM KAND 11 içeren veya içermeyen MS plakalarında yetiştirilen propidium iyodür ile boyanmış yabani tip Col köklerinin konfokal mikroskopisi. Beyaz parantezler kök meristemini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (d) Kök meristem boyutunun nicelleştirilmesi (n = 10 ila 11). İstatistiksel farklılıklar t-testi kullanılarak belirlenmiştir (p< 0,05). Çubuklar ortalama meristem boyutunu temsil eder. (e) CDKB2 yapısını içeren bir kök meristeminin diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskobu; 1pro: CDKB2; 1-GUS ile boyanmış ve 25 µM KAND testi ile veya test olmadan MS plakalarında yetiştirilen 5 günlük fideler üzerinde boyanmıştır.
KAND 11'in fitotoksik etkisi, başka bir çift çenekli bitki olan tütün (Nicotiana tabacum) ve önemli bir kara bitkisi model organizması olan karaciğer yosunu (Marchantia polymorpha) kullanılarak daha da test edildi. Arabidopsis'te olduğu gibi, 25 μM KAND 11 içeren ortamda yetiştirilen tütün SR-1 fideleri daha kısa kökler üretti (Şekil 5a). Ek olarak, 200 μM KAND 11 içeren plakalarda 48 tohumdan 40'ı çimlenirken, kontrol grubu olarak kullanılan ortamlarda 48 tohumun tamamı çimlendi; bu da daha yüksek KAND konsantrasyonlarının anlamlı olduğunu gösteriyor (p < 0.05).< 0,05; ki kare testi) tütünün çimlenmesini engelledi (Şekil 5b). Ek olarak, karaciğer yosununda bakteri büyümesini engelleyen KAND 11 konsantrasyonu, Arabidopsis'teki etkili konsantrasyona benzerdi (Şekil 5c). Bu sonuçlar, KAND 11'in çeşitli bitkilerin büyümesini engelleyebileceğini göstermektedir. Daha sonra, diğer organizmalarda, yani sırasıyla daha yüksek hayvan ve bakteri hücrelerinin temsilcileri olarak insan HeLa hücrelerinde ve Escherichia coli DH5α suşunda, ayı monoamid ile ilgili bileşiklerin olası sitotoksisitesini araştırdık. Bir dizi hücre çoğalma deneyinde, kumaronamid 1, kumaronamidik asit 6 ve KAND 11'in 100 μM konsantrasyonlarında HeLa veya E. coli hücrelerinin büyümesini etkilemediğini gözlemledik (Şekil 5d,e).
KAND 11'in Arabidopsis olmayan organizmalarda büyüme inhibisyonu. (a) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 25 μM KAND 11 içeren dikey konumlandırılmış MS plakalarında yetiştirildi. (b) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 200 μM KAND 11 içeren yatay konumlandırılmış MS plakalarında yetiştirildi. (c) İki haftalık yabani tip Tak-1 karaciğer yosunu tomurcukları, belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarıyla Gamborg B5 plakalarında yetiştirildi. Kırmızı oklar, iki haftalık kuluçka süresi içinde büyümeyi durduran sporları göstermektedir. (d) HeLa hücrelerinin hücre çoğalma testi. Canlı hücre sayısı, hücre sayım kiti 8 (Dojindo) kullanılarak sabit zaman aralıklarında ölçüldü. Kontrol olarak, HeLa hücreleri RNA polimeraz transkripsiyonunu inhibe eden ve hücre ölümüne neden olan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D) ile muamele edildi. Analizler üçlü tekrarlar halinde yapıldı. (e) E. coli hücre çoğalma deneyi. E. coli büyümesi OD600 ölçülerek analiz edildi. Kontrol olarak, hücreler bakteriyel hücre duvarı sentezini inhibe eden 50 μg/ml ampisilin (Amp) ile muamele edildi. Analizler üçlü tekrarlar halinde yapıldı.
Uramid ile ilgili bileşiklerin neden olduğu sitotoksisitenin etki mekanizmasını çözmek için, orta derecede inhibitör etkiye sahip urbenik asit türevlerini yeniden analiz ettik (Şekil 2b, 6a'da gösterildiği gibi). Şekil 2b ve 6a'da gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda (200 μM) urmotonik asit 6 içeren agar plakalarında yetiştirilen fideler daha kısa ve sola doğru kıvrılmış kökler (θ = – 23,7 ± 6,1) üretirken, kontrol ortamında yetiştirilen fideler neredeyse düz kökler (θ = – 3,8 ± 7,1) üretti. Bu karakteristik eğik büyümenin kortikal mikrotübüllerin işlev bozukluğundan kaynaklandığı bilinmektedir14,18. Bu bulguyla tutarlı olarak, mikrotübül destabilize edici ilaçlar disopiramid ve orizalin, büyüme koşullarımız altında benzer kök eğilmesine neden oldu (Şekil 2b, 6a). Aynı zamanda, urmotonik asit türevlerini test ettik ve belirli konsantrasyonlarda eğik kök büyümesine neden olan birkaçını seçtik. Bileşikler 8, 9 ve 15, sırasıyla 75 μM, 50 μM ve 40 μM'de kök büyümesinin yönünü değiştirdi; bu da bu bileşiklerin mikrotübülleri etkili bir şekilde destabilize edebildiğini gösteriyor (Şekil 2b, 6a). Ayrıca en güçlü ursolik asit türevi olan KAND 11'i daha düşük bir konsantrasyonda (15 µM) test ettik ve KAND 11 uygulamasının kök büyümesini engellediğini ve kök büyümesinin yönünün düzensiz olduğunu, ancak sola doğru eğilme eğiliminde olduğunu bulduk (Şekil C3). Mikrotübül destabilize edici ilaçların daha yüksek konsantrasyonlarının bazen kök eğilmesine neden olmak yerine bitki büyümesini engellediği için, daha sonra KAND 11'in mikrotübülleri etkileyip etkilemediğini kök epidermal hücrelerindeki kortikal mikrotübülleri gözlemleyerek değerlendirdik. 25 μM KAND 11 ile muamele edilen fide köklerinin epidermal hücrelerinde anti-β-tubulin antikorları kullanılarak yapılan immünohistokimya, uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüllerin neredeyse tamamının kaybolduğunu göstermiştir (Şekil 6b). Bu sonuçlar, kumamotonik asit ve türevlerinin mikrotübüllere doğrudan veya dolaylı olarak etki ederek onları bozduğunu ve bu bileşiklerin yeni mikrotübül inhibitörleri olduğunu göstermektedir.
Ursonik asit ve türevleri, Arabidopsis thaliana'da kortikal mikrotübülleri değiştirir. (a) Belirtilen konsantrasyonlarda çeşitli ursonik asit türevlerinin varlığında ölçülen kök eğim açısı. Mikrotübülleri inhibe ettiği bilinen iki bileşiğin (disopiramid ve orizalin) etkileri de analiz edildi. Ek kısım, kök büyüme açısını ölçmek için kullanılan standardı göstermektedir. Yıldız işaretleri, sahte işlemle anlamlı farklılıkları göstermektedir (t testi, p < 0.05).< 0.05). n>19. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüller. 25 μM KAND 11 içeren veya içermeyen MS plakalarında yetiştirilen yabani tip Arabidopsis Col köklerindeki mikrotübüller, β-tübülin birincil antikorları ve Alexa Fluor konjugeli ikincil antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal boyama ile görselleştirildi. Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Kök meristemindeki mikrotübüllerin mitotik yapısı. Mikrotübüller immünohistokimyasal boyama kullanılarak görselleştirildi. Profaz bölgeleri, iğler ve fragmoplastlar dahil olmak üzere mitotik yapılar, konfokal görüntülerden sayıldı. Oklar mitotik mikrotübül yapılarını göstermektedir. Yıldız işaretleri, sahte tedavi ile anlamlı farklılıkları göstermektedir (t testi, p < 0.05).< 0.05). n>9. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Ursa'nın mikrotübül fonksiyonunu bozma yeteneğine sahip olmasına rağmen, etki mekanizmasının tipik mikrotübül depolimerize edici ajanlardan farklı olması beklenmektedir. Örneğin, disopiramid ve orizalin gibi mikrotübül depolimerize edici ajanların daha yüksek konsantrasyonları epidermal hücrelerin anizotropik genişlemesine neden olurken, KAND 11 bunu yapmaz. Ek olarak, KAND 11 ve disopiramidin birlikte uygulanması, disopiramid kaynaklı kök büyüme yanıtı ve KAND 11 kaynaklı büyüme inhibisyonunun bir arada görülmesine neden olmuştur (Şekil S4). Ayrıca, aşırı duyarlı disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11'e verdiği yanıtı da analiz ettik. phs1-1, kanonik olmayan bir tübülin kinaz nokta mutasyonuna sahiptir ve disopiramid ile muamele edildiğinde daha kısa kökler üretir9,20. KAND 11 içeren agar ortamında yetiştirilen phs1-1 mutant fidelerinin, disopiramid üzerinde yetiştirilenlere benzer şekilde daha kısa kökleri vardı (Şekil S5).
Ek olarak, KAND 11 ile muamele edilen fidelerin kök meristeminde profaz bölgeleri, iğler ve fragmoplastlar gibi mitotik mikrotübül yapıları gözlemledik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS için yapılan gözlemlerle tutarlı olarak, mitotik mikrotübül sayısında önemli bir azalma gözlemlendi (Şekil 6c).
KAND 11'in hücre altı çözünürlükte sitotoksisitesini karakterize etmek için, tütün BY-2 süspansiyon hücrelerini KAND 11 ile muamele ettik ve yanıtlarını gözlemledik. İlk olarak, KAND 11'in kortikal mikrotübüller üzerindeki etkisini değerlendirmek için, mikrotübülleri floresan olarak etiketleyen TagRFP-TUA6'yı ifade eden BY-2 hücrelerine KAND 11 ekledik. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini ölçen görüntü analizi kullanılarak değerlendirildi. Deney sonuçları, 1 saat boyunca 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile muameleden sonra yoğunluğun sırasıyla %0,94 ± 0,74 veya %0,23 ± 0,28'e önemli ölçüde azaldığını, DMSO ile muamele edilen hücrelerin yoğunluğunun ise %1,61 ± 0,34 olduğunu gösterdi (Şekil 7a). Bu sonuçlar, Arabidopsis'te KAND 11 tedavisinin kortikal mikrotübüllerin depolimerizasyonuna neden olduğu gözlemiyle tutarlıdır (Şekil 6b). Ayrıca, aynı konsantrasyonda KAND 11 ile tedavi edildikten sonra GFP-ABD etiketli aktin filamentlerine sahip BY-2 hattını inceledik ve KAND 11 tedavisinin aktin filamentlerini bozduğunu gözlemledik. 1 saat boyunca 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile tedavi, aktin filament yoğunluğunu sırasıyla %1,20 ± 0,62 veya %0,61 ± 0,26'ya önemli ölçüde düşürürken, DMSO ile tedavi edilen hücrelerdeki yoğunluk %1,69 ± 0,51 idi (Şekil 2). 7b). Bu sonuçlar, aktin filamentlerini etkilemeyen propizamid ve mikrotübülleri etkilemeyen bir aktin depolimerizatörü olan latrunculin B'nin etkileriyle çelişmektedir (Ek Şekil S6). Ek olarak, kumarinamid 1, kumarinamid asit 6 veya KAND 11 ile yapılan tedavi, HeLa hücrelerindeki mikrotübülleri etkilemedi (Ek Şekil S7). Bu nedenle, KAND 11'in etki mekanizmasının bilinen sitoskeleton bozucularından farklı olduğuna inanılmaktadır. Ayrıca, KAND 11 ile tedavi edilen BY-2 hücrelerinin mikroskobik gözlemi, KAND 11 tedavisi sırasında hücre ölümünün başladığını ortaya koydu ve Evans mavisi ile boyanmış ölü hücrelerin oranının 30 dakika KAND 11 tedavisinden sonra önemli ölçüde artmadığını, oysa 50 μM veya 100 μM KAND ile 90 dakika tedaviden sonra ölü hücre sayısının sırasıyla %43,7 veya %80,1'e yükseldiğini gösterdi (Şekil 7c). Toplu olarak ele alındığında, bu veriler, yeni ursolik asit türevi KAND 11'in, daha önce bilinmeyen bir etki mekanizmasına sahip bitkiye özgü bir sitoskeletal inhibitör olduğunu göstermektedir.
KAND, kortikal mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve tütün BY-2 hücrelerinin canlılığını etkiler. (a) TagRFP-TUA6 varlığında BY-2 hücrelerinde kortikal mikrotübüllerin görselleştirilmesi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile muamele edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler anlamlı farklılıkları gösterir (Tukey HSD testi, p < 0.05).< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (b) GFP-ABD2 varlığında BY-2 hücrelerindeki kortikal aktin filamentleri görselleştirildi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile muamele edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal aktin filamentlerinin yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler anlamlı farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p < 0,05).< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Evans mavisi boyama ile ölü BY-2 hücrelerinin gözlemlenmesi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile muamele edilen BY-2 hücreleri parlak alan mikroskobu ile incelendi. n=3. Ölçek çubuğu = 100 µm.
Yeni doğal ürünlerin keşfi ve uygulaması, tıp ve tarım da dahil olmak üzere insan yaşamının çeşitli yönlerinde önemli ilerlemelere yol açmıştır. Tarihsel araştırmalar, doğal kaynaklardan yararlı bileşikler elde etmek için yürütülmüştür. Özellikle aktinomisetler, ivermektinin öncü bileşiği olan avermektin ve tıbbi olarak kanser önleyici ajan olarak kullanılan bleomisin ve türevleri gibi çeşitli ikincil metabolitler üretme yetenekleri nedeniyle nematodlar için antiparazitik antibiyotikler olarak yararlı oldukları bilinmektedir.21,22 Benzer şekilde, aktinomisetlerden çeşitli herbisit bileşikleri keşfedilmiştir ve bunların bazıları halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır.1,23 Bu nedenle, istenen biyolojik aktivitelere sahip doğal ürünleri izole etmek için aktinomiset metabolitlerinin analizi etkili bir strateji olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada, S. werraensis'ten yeni bir bileşik olan kumaronamidi keşfettik ve başarılı bir şekilde sentezledik. Ursonik asit, urbenamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesidir. Bu madde, karakteristik kök kıvrılmasına neden olabilir, orta ila güçlü herbisit aktivitesi gösterebilir ve bitki mikrotübüllerine doğrudan veya dolaylı olarak zarar verebilir. Bununla birlikte, ürmotonik asidin etki mekanizması, mevcut mikrotübül inhibitörlerinden farklı olabilir, çünkü KAND 11 aynı zamanda aktin filamentlerini bozar ve hücre ölümüne neden olur; bu da ürmotonik asit ve türevlerinin çok çeşitli sitoskeletal yapıları etkilediği bir düzenleyici mekanizmayı düşündürmektedir.
Ursonik asidin daha detaylı karakterizasyonu, etki mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Özellikle, bir sonraki hedef, ursonik asidin indirgenmiş mikrotübüllere bağlanma yeteneğini değerlendirerek, ursonik asit ve türevlerinin doğrudan mikrotübüllere etki edip onları depolimerize mi ettiğini yoksa etkilerinin mikrotübül destabilizasyonuna mı yol açtığını belirlemektir. Ayrıca, mikrotübüllerin doğrudan hedef olmadığı durumlarda, ursonik asidin bitki hücrelerindeki etki yerini ve moleküler hedeflerini belirlemek, ilgili bileşiklerin özelliklerini ve herbisit aktivitesini iyileştirmenin olası yollarını daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Biyoaktivite testimiz, ursonik asidin Arabidopsis thaliana, tütün ve karaciğer otu gibi bitkilerin büyümesi üzerinde benzersiz sitotoksik yeteneğini ortaya koyarken, E. coli ve HeLa hücreleri etkilenmemiştir. Hayvan hücrelerine karşı az veya hiç toksisite göstermemesi, ursonik asit türevlerinin açık tarım alanlarında herbisit olarak geliştirilmeleri durumunda bir avantajdır. Gerçekten de, mikrotübüller ökaryotlarda yaygın yapılar olduğundan, bitkilerde seçici inhibisyonları herbisitler için temel bir gerekliliktir. Örneğin, doğrudan tübüline bağlanan ve polimerizasyonu inhibe eden bir mikrotübül depolimerize edici ajan olan propizamid, hayvan hücrelerine karşı düşük toksisitesi nedeniyle herbisit olarak kullanılır.24 Disopiramidin aksine, ilgili benzamidlerin farklı hedef özgüllükleri vardır. Bitki mikrotübüllerine ek olarak, RH-4032 veya benzoksamid sırasıyla hayvan hücrelerinin veya oomisetlerin mikrotübüllerini de inhibe eder ve zalilamid düşük fitotoksisitesi nedeniyle fungisit olarak kullanılır.25,26,27 Yeni keşfedilen bear ve türevleri bitkilere karşı seçici sitotoksisite sergiler, ancak daha fazla modifikasyonun hedef özgüllüklerini değiştirebileceği ve potansiyel olarak patojenik mantarların veya oomisetlerin kontrolü için ek türevler sağlayabileceği dikkate değerdir.
Urbenonik asit ve türevlerinin benzersiz özellikleri, herbisit olarak geliştirilmeleri ve araştırma araçları olarak kullanılmaları açısından faydalıdır. Bitki hücresi şeklinin kontrolünde sitoskeletin önemi yaygın olarak kabul edilmektedir. Daha önceki çalışmalar, bitkilerin, morfojenezin doğru şekilde kontrol edilmesi için mikrotübül dinamiklerini kontrol ederek kortikal mikrotübül organizasyonunun karmaşık mekanizmalarını geliştirdiğini göstermiştir. Mikrotübül aktivitesinin düzenlenmesinden sorumlu çok sayıda molekül tanımlanmıştır ve ilgili araştırmalar hala devam etmektedir3,4,28. Bitki hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerine ilişkin mevcut anlayışımız, kortikal mikrotübül organizasyon mekanizmalarını tam olarak açıklamamaktadır. Örneğin, hem disopiramid hem de orizalin mikrotübülleri depolimerize edebilse de, disopiramid ciddi kök deformasyonuna neden olurken, orizalin nispeten hafif bir etkiye sahiptir. Dahası, mikrotübülleri stabilize eden tubulin'deki mutasyonlar da köklerde dekstrorotasyona neden olurken, mikrotübül dinamiklerini stabilize eden paklitaksel böyle bir etkiye neden olmaz. Bu nedenle, ursolik asidin moleküler hedeflerinin incelenmesi ve tanımlanması, bitki korteks mikrotübüllerinin düzenlenmesine ilişkin yeni bilgiler sağlayacaktır. Benzer şekilde, disopiramid gibi bozuk büyümeyi teşvik etmede etkili olan kimyasallar ile oryzalin veya kumamotorik asit gibi daha az etkili kimyasalların gelecekteki karşılaştırmaları, bozuk büyümenin nasıl meydana geldiğine dair ipuçları verecektir.
Öte yandan, savunmayla ilgili sitoskeletal yeniden düzenlemeler, ursonik asidin sitotoksisitesini açıklayabilecek başka bir olasılıktır. Bir patojenin enfeksiyonu veya bitki hücrelerine bir uyarıcının girmesi bazen sitoskeletin tahribatına ve ardından hücre ölümüne neden olur29. Örneğin, oomiset kaynaklı kriptoksantinin, KAND tedavisiyle meydana gelenlere benzer şekilde, tütün hücresi ölümünden önce mikrotübülleri ve aktin filamentlerini bozduğu bildirilmiştir30,31. Savunma tepkileri ile ursonik asit tarafından indüklenen hücresel tepkiler arasındaki benzerlikler, ursonik asidin kriptoksantinden daha hızlı ve daha güçlü bir etkiye sahip olmasına rağmen, ortak hücresel süreçleri tetikledikleri hipotezini ortaya atmamıza yol açmıştır. Bununla birlikte, çalışmalar aktin filamentlerinin bozulmasının, her zaman mikrotübül bozulmasıyla birlikte olmayan spontan hücre ölümünü teşvik ettiğini göstermiştir29. Ayrıca, patojenin veya uyarıcının, ursonik asit türevlerinde olduğu gibi, bozulmuş kök büyümesine neden olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Dolayısıyla, savunma tepkileri ile hücre iskeleti arasındaki bağlantıyı kuran moleküler bilgi, ele alınması gereken cazip bir sorundur. Ursonik asit ile ilişkili düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin yanı sıra, farklı potansiyellere sahip bir dizi türevinin varlığından yararlanarak, bilinmeyen hücresel mekanizmaları hedefleme fırsatları sağlanabilir.
Özetle, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen yeni bileşiklerin keşfi ve uygulaması, bitki hücresi şeklinin belirlenmesinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmaları ele almak için güçlü yöntemler sağlayacaktır. Bu bağlamda, mikrotübülleri ve aktin filamentlerini etkileyen ve hücre ölümüne neden olan yakın zamanda geliştirilen urmotonik asit bileşiği, mikrotübül kontrolü ile bu diğer mekanizmalar arasındaki bağlantıyı çözmek için bir fırsat sunabilir. Dolayısıyla, urbenonik asit kullanılarak yapılan kimyasal ve biyolojik analizler, bitki sitoskeletini kontrol eden moleküler düzenleyici mekanizmaları anlamamıza yardımcı olacaktır.
S. werraensis MK493-CF1 suşunu, %2 (a/h) galaktoz, %2 (a/h) Essence macunu, %1 (a/h) Bacto kompozisyonu -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), %0,5 (a/h) mısır özütü (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), %0,2 (a/h) (NH4)2SO4 ve %0,2 CaCO3 içeren 110 mL tohum ortamı bulunan 500 mL'lik bölmeli bir Erlenmeyer şişesine aşılayın (sterilizasyondan önce pH 7,4). Tohum kültürleri, 27°C'de 2 gün boyunca döner çalkalayıcıda (180 rpm) inkübe edildi. Üretim, katı hal fermantasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Tohum kültürü (7 ml), 15 g preslenmiş arpa (MUSO Co., Ltd., Japonya) ve 25 g deiyonize sudan (pH sterilizasyondan önce ayarlanmamış) oluşan 40 g üretim ortamı içeren 500 ml'lik bir K-1 şişesine aktarıldı. Fermantasyon 30°C'de karanlıkta 14 gün boyunca gerçekleştirildi. Fermantasyon materyali 40 ml/şişe EtOH ile ekstrakte edildi ve santrifüjlendi (1500 g, 4°C, 10 dk). Kültür süpernatantı (60 ml), %10 MeOH/EtOAc karışımı ile ekstrakte edildi. Organik katman, azaltılmış basınç altında buharlaştırılarak bir kalıntı (59,5 mg) elde edildi ve bu kalıntı, ters fazlı bir kolonda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, iç çap 10 mm × uzunluk 250 mm) gradyan elüsyonu (0–10 dakika: %90) ile HPLC'ye tabi tutuldu: H2O/CH3CN, 10–35 dakika: %90 H2O/CH3CN'den %70 H2O/CH3CN'ye (gradyan), 35–45 dakika: %90 H2O/EtOH, 45–155 dakika: %90 H2O/EtOH'den %100 EtOH'ye (gradyan), 155–200 dakika: %100 EtOH) 1,5 ml/dakika akış hızında, beyaz amorf bir toz halinde kumarinamid (1, 36,0 mg) izole edildi.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesaplanan değer: 141.0659, ölçülen değer: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia tohumları (Col-0), araştırma amaçlı kullanım izniyle Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi'nden (ABRC) temin edildi. Col-0 tohumları laboratuvar koşullarımızda çoğaltıldı ve yabani tip Arabidopsis bitkileri olarak kullanıldı. Arabidopsis tohumları yüzey sterilizasyonundan geçirildi ve %2 sakaroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), %0,05 (a/h) 2-(4-morfolino)etansülfonik asit (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ve %1,5 agar (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü Murashige ve Skoog ortamında, pH 5,7'de, 23 °C'de ve sabit ışık altında kültüre edildi. phs1-1 mutantının tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı.
SR-1 suşunun tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından temin edildi ve yabani tip tütün bitkileri olarak kullanıldı. Tütün tohumları yüzey sterilizasyonundan geçirildi ve çimlenmeyi teşvik etmek için üç gece steril suda bekletildi, ardından %2 sakaroz, %0,05 (a/h) MES ve %0,8 gellan zamkı (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü bir çözeltiye (Murashige ve Skoog ortamı) pH 5,7'de yerleştirildi ve 23°C'de sabit ışık altında inkübe edildi.
Tak-1 suşu T. Kohchi (Kyoto Üniversitesi) tarafından temin edilmiş olup, karaciğer yosunu çalışması için standart deney birimi olarak kullanılmıştır. Embriyo, sterilize edilmiş kültür bitkilerinden elde edilmiş ve daha sonra %1 sakaroz ve %0,3 gellan zamkı içeren Gamborg B5 ortamına (Fujifilm Wako Pure Chemical) ekilerek 23°C'de sürekli ışık altında inkübe edilmiştir.
Tütün BY-2 hücreleri (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2), S. Hasezawa (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlandı. BY-2 hücreleri, modifiye Linsmeier ve Skoog ortamında 95 kat seyreltildi ve haftalık olarak 2,4-diklorofenoksiasetik asit 32 ile desteklendi. Hücre süspansiyonu, karanlıkta 27°C'de 130 rpm'de döner bir çalkalayıcıda karıştırıldı. Hücreler, hacminin 10 katı taze ortamla yıkandı ve aynı ortamda yeniden süspansiyon haline getirildi. Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü altında mikrotübül belirteci TagRFP-TUA6 veya aktin filament belirteci GFP-ABD2'yi kararlı bir şekilde ifade eden BY-2 transgenik hücre hatları, tarif edildiği gibi oluşturuldu33,34,35. Bu hücre hatları, orijinal BY-2 hücre hattı için kullanılanlara benzer prosedürler kullanılarak korunabilir ve senkronize edilebilir.
HeLa hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 1,2 U/ml penisilin ve 1,2 μg/ml streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) (Life Technologies) %5 CO2'li 37°C'lik bir inkübatörde kültüre edildi.
Bu makalede açıklanan tüm deneyler, Japon biyolojik güvenlik düzenlemeleri ve yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Bileşikler, stok çözeltiler halinde dimetil sülfoksit (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) içinde çözülmüş ve Arabidopsis ve tütün için MS ortamında veya karaciğer yosunu için Gamborg B5 ortamında seyreltilmiştir. Kök büyüme inhibisyonu deneyi için, belirtilen bileşikleri veya DMSO'yu içeren agar ortamına plaka başına 10'dan fazla tohum ekilmiştir. Tohumlar 7 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edilmiştir. Fideler fotoğraflanmış ve kök uzunlukları ölçülmüştür. Arabidopsis çimlenme deneyi için, 200 μM bileşik veya DMSO içeren agar ortamına plaka başına 48 tohum ekilmiştir. Arabidopsis tohumları bir büyüme odasında yetiştirilmiş ve çimlenmeden 7 gün sonra (dag) çimlenen fide sayısı sayılmıştır. Tütün çimlenme deneyi için, 200 μM KAND veya DMSO içeren agar ortamına plaka başına 24 tohum ekilmiştir. Tütün tohumları bir büyüme odasında yetiştirilmiş ve 14 gün sonra çimlenen fide sayısı sayılmıştır. Karaciğer yosunu büyüme inhibisyonu deneyi için, her plakadan 9 embriyo, belirtilen konsantrasyonlarda KAND veya DMSO içeren agar ortamına ekildi ve 14 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi.
Kök meristem organizasyonunu görselleştirmek için 5 mg/ml propidium iyodür (PI) ile boyanmış fideler kullanıldı. PI sinyalleri, TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak floresan mikroskopi ile gözlemlendi.
Köklerin β-glukuronidaz (GUS) ile histokimyasal boyanması, Malami ve Benfey36 tarafından açıklanan protokole göre gerçekleştirildi. Fideler gece boyunca %90 asetonda sabitlendi, 1 saat boyunca GUS tamponunda 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik asit ile boyandı ve hidratlanmış kloraldehit çözeltisine (8 g kloral hidrat, 2 ml su ve 1 ml gliserol) yerleştirildi ve Axio Imager M1 mikroskobu (Carl Zeiss) kullanılarak diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile gözlemlendi.
Dikey olarak yerleştirilmiş plakalarda yetiştirilen 7 günlük fidelerin kök açıları ölçüldü. Kök açısını, 6. adımda açıklandığı gibi yerçekimi vektörü yönünden ölçün.
Kortikal mikrotübüllerin düzenlenmesi, protokol 37'de yapılan küçük değişikliklerle tarif edildiği gibi gözlemlendi. Birincil ve ikincil antikorlar olarak sırasıyla 1:1000 ve 1:100 seyreltmelerde anti-β-tübülin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ve Alexa Fluor 488 konjugeli anti-fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) kullanıldı. Floresans görüntüleri, bir TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak elde edildi. Üreticinin talimatlarına göre Z-yığın görüntüleri alın ve maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.
HeLa hücre çoğalma testi, üreticinin talimatlarına göre Cell Counting Kit 8 (Dojindo) kullanılarak gerçekleştirildi.
E. coli DH5α'nın büyümesi, kültür ortamında hücre yoğunluğunun 600 nm'de (OD600) spektrofotometre kullanılarak ölçülmesiyle analiz edildi.
Transgenik BY-2 hücrelerindeki sitoskeletal organizasyon, CSU-X1 konfokal tarama cihazı (Yokogawa) ve sCMOS kamera (Zyla, Andor Technology) ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak gözlemlendi. Sitoskeletal yoğunluk, ImageJ yazılımı kullanılarak konfokal görüntülerdeki sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini nicelendiren görüntü analizi ile değerlendirildi38,39.
BY-2 hücrelerinde hücre ölümünü tespit etmek için, hücre süspansiyonunun bir kısmı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,05 Evans mavisi ile inkübe edildi. Ölü hücrelerin seçici Evans mavisi ile boyanması, boyanın sağlam plazma zarı tarafından canlı hücrelerden dışarı atılmasına bağlıdır40. Boyanmış hücreler, parlak alan mikroskobu (BX53, Olympus) kullanılarak gözlemlendi.
HeLa hücreleri, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C ve %5 CO2'de %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de yetiştirildi. Hücreler, 37°C'de 6 saat boyunca 100 μM KAND 11, kumamonamik asit 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) veya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ile muamele edildi. Hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca MetOH ve ardından 5 dakika boyunca asetat ile sabitlendi. Sabitlenmiş hücreler, %0,5 BSA/PBS içinde seyreltilmiş β-tubulin birincil antikor (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ile 2 saat inkübe edildi, TBST ile 3 kez yıkandı ve ardından Alexa Fluor keçi antikoru ile 1 saat inkübe edildi. – Fare IgG'si (Thermo Fisher Scientific: A11001) ve 0.5% BSA/PBS içinde seyreltilmiş 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). TBST ile üç kez yıkandıktan sonra, boyanmış hücreler Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopta gözlemlendi. Görüntüler, MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak soğutmalı Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera ile yakalandı.
Yayın tarihi: 17 Haz-2024