Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi sonuçlar için, tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stil veya JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Doğal ürünlerin keşfi ve faydalı kullanımı insan yaşamını iyileştirmeye yardımcı olabilir. Bitki büyümesini engelleyen kimyasallar yabani otları kontrol etmek için yaygın olarak herbisit olarak kullanılır. Farklı herbisit türlerinin kullanılması ihtiyacı nedeniyle, yeni etki mekanizmalarına sahip bileşiklerin tanımlanmasına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1'den yeni bir N-alkoksipirol bileşiği olan kumaramonamid keşfettik ve tam sentez sürecini oluşturduk. Biyolojik aktivite denemeleri yoluyla, urs-monoamik asidin urs-monoamidin sentetik bir ara maddesi olduğunu ve potansiyel birbitki büyüme inhibitörü. Ayrıca, HeLa hücrelerinin büyümesini olumsuz etkilemeden yüksek herbisit aktivitesine sahip olan urbenyloxy türevi (UDA) dahil olmak üzere çeşitli urbenonik asit türevleri geliştirdik. Ayrıca, urmotonik asit türevlerinin bitki mikrotübüllerini bozduğunu; ayrıca, KAND'nin aktin filamentlerini etkilediğini ve hücre ölümünü indüklediğini bulduk; Bu çok yönlü etkiler, bilinen mikrotübül inhibitörlerinin etkilerinden farklıdır ve ursonik asit için yeni bir etki mekanizması önermektedir; bu da yeni herbisitlerin geliştirilmesinde önemli bir avantaj sağlamaktadır.
Faydalı doğal ürünlerin ve bunların türevlerinin keşfi ve pratik uygulaması, insan yaşam kalitesini iyileştirmenin bir yoludur. Mikroorganizmalar, bitkiler ve böcekler tarafından üretilen ikincil metabolitler tıp ve tarımda büyük ilerlemelere yol açmıştır. Birçok antibiyotik ve lösemi karşıtı ilaç doğal ürünlerden geliştirilmiştir. Ayrıca, çeşitli tiplerpestisitler, tarımda kullanılmak üzere bu doğal ürünlerden fungisitler ve herbisitler çıkarılır. Özellikle, yabani ot kontrol herbisitleri modern tarımda ürün verimini artırmak için önemli araçlardır ve çeşitli bileşik türleri halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır. Fotosentez, amino asit metabolizması, hücre duvarı sentezi, mitozun düzenlenmesi, fitohormon sinyalizasyonu veya protein sentezi gibi bitkilerdeki çeşitli hücresel süreçler herbisitlerin tipik hedefleri olarak kabul edilir. Mikrotübül fonksiyonunu engelleyen bileşikler, mitotik düzenlemeyi etkileyerek bitki büyümesini etkileyen yaygın bir herbisit sınıfıdır2.
Mikrotübüller sitoskeletonun bileşenleridir ve ökaryotik hücrelerde yaygın olarak korunurlar. Tübülin heterodimeri, 13 protofilamentin silindirik bir yapı oluşturduğu doğrusal mikrotübül protofilamentleri oluşturan α-tübülin ve β-tübülinden oluşur. Mikrotübüller, hücre şeklini, hücre bölünmesini ve hücre içi taşımayı belirlemek de dahil olmak üzere bitki hücrelerinde birden fazla rol oynar3,4. Bitki hücreleri, interfaz plazma membranının altında mikrotübüller içerir ve bu sözde kortikal mikrotübüllerin, selüloz sentaz komplekslerinin düzenlenmesi yoluyla selüloz mikrofibrillerinin organizasyonunu kontrol ettiği düşünülmektedir4,5. Kök ucunun hızlı uzama bölgesinde bulunan kök epidermal hücrelerinin kortikal mikrotübülleri, yanal olarak yerleşmiştir ve selüloz mikrolifleri bu mikrotübülleri takip ederek hücre genişlemesinin yönünü sınırlar ve böylece anizotropik hücre uzamasını teşvik eder. Bu nedenle, mikrotübül işlevi bitki morfolojisiyle yakından ilişkilidir. Tübülin kodlayan genlerdeki amino asit değişimleri, kortikal mikrotübül dizilerinin çarpıklığına ve Arabidopsis'te sol veya sağ taraflı büyümeye neden olur 6,7. Benzer şekilde, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen mikrotübül ilişkili proteinlerdeki mutasyonlar da çarpık kök büyümesine yol açabilir8,9,10,11,12,13. Ek olarak, disopiramid (pretilaklor olarak da bilinir) gibi mikrotübül bozucu herbisitlerle tedavi de sol taraflı eğik kök büyümesine neden olur14. Bu veriler, mikrotübül fonksiyonunun hassas bir şekilde düzenlenmesinin bitki büyümesinin yönünü belirlemek için kritik olduğunu göstermektedir.
Çeşitli tipte mikrotübül inhibitörleri keşfedildi ve bu ilaçlar sitoskeletal araştırmanın yanı sıra tarım ve tıbba da önemli katkılarda bulundu2. Özellikle orizalin, dinitroanilin bileşikleri, disopiramid, benzamid ile ilişkili bileşikler ve bunların analogları mikrotübül fonksiyonunu inhibe edebilir ve dolayısıyla bitki büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, herbisit olarak yaygın olarak kullanılırlar. Ancak, mikrotübüller bitki ve hayvan hücrelerinin önemli bir bileşeni olduğundan, çoğu mikrotübül inhibitörü her iki hücre tipi için de sitotoksiktir. Bu nedenle, herbisit olarak bilinen faydalarına rağmen, pratik amaçlar için sınırlı sayıda antimikrotübül ajanı kullanılmaktadır.
Streptomyces, aerobik, gram-pozitif, filamentli bakterileri içeren Streptomyces ailesinin bir cinsidir ve çok çeşitli ikincil metabolitler üretme yeteneğiyle yaygın olarak bilinir. Bu nedenle, biyolojik olarak aktif yeni doğal ürünlerin en önemli kaynaklarından biri olarak kabul edilir. Mevcut çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1 ve S. werraensis ISP 5486'dan izole edilen coumamonamid adı verilen yeni bir bileşik keşfettik. Spektral analiz ve tam spektral analiz kullanılarak, coumamonamidin yapısı karakterize edildi ve benzersiz N-alkoksipirol iskeleti belirlendi. sentez. Ursmonoamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesi olan ursmonik asidin, popüler model bitki Arabidopsis thaliana'nın büyümesini ve çimlenmesini engellediği bulundu. Yapı-aktivite ilişkisi çalışmasında, ursonik aside modifiye edilmiş C9'lu bir bileşiğin, ursonik asidin noniloksi türevi (KAND) olarak adlandırılan, büyüme ve çimlenme üzerindeki inhibitör etkisini önemli ölçüde artırdığını bulduk. Özellikle, yeni keşfedilen bitki büyüme inhibitörü tütün ve ciğer otunun büyümesini de etkiledi ve bakteri veya HeLa hücreleri için sitotoksik değildi. Dahası, bazı urmotonik asit türevleri çarpık bir kök fenotipine neden olur, bu da bu türevlerin doğrudan veya dolaylı olarak mikrotübülleri etkilediği anlamına gelir. Bu fikirle tutarlı olarak, immünohistokimyasal olarak veya floresan proteinlerle etiketlenmiş mikrotübüller hakkındaki gözlemlerimiz, KAND tedavisinin mikrotübülleri depolimerize ettiğini göstermektedir. Ek olarak, kumamotonik asit türevleriyle tedavi aktin mikrofilamentlerini bozdu. Bu nedenle, benzersiz etki mekanizması sitoskeletonun yıkımını içeren yeni bir bitki büyüme inhibitörü keşfettik.
MK493-CF1 suşu Tokyo'daki Shinagawa-ku'daki topraktan izole edildi. MK493-CF1 suşu iyi dallanmış stromal miselyum oluşturdu. 16S ribozomal RNA geninin kısmi dizisi (1422 bp) belirlendi. Bu suş S. werraensis'e çok benzemektedir (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik suş, %99,93). Bu sonuca dayanarak, bu suşun S. werraensis'in tip suşuyla yakından ilişkili olduğu belirlendi. Bu nedenle, bu suşa geçici olarak S. werraensis MK493-CF1 adını verdik. S. werraensis ISP 5486T de aynı biyoaktif bileşikleri üretir. Bu mikroorganizmadan doğal ürünler elde etmek için erken dönemde çok az araştırma yapıldığından, daha fazla kimyasal araştırma yürütülmüştür. S. werraensis MK493-CF1'in 30°C'de 14 gün boyunca katı hal fermantasyonu ile arpa ortamında yetiştirilmesinden sonra, ortam %50 EtOH ile ekstre edildi. 60 ml numune kurutularak 59,5 mg ham özüt elde edildi. Ham özüt, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, coumamonamid olarak adlandırılmış, 36,0 mg) elde etmek için ters faz HPLC'ye tabi tutuldu. 1'in toplam miktarı ham özütün yaklaşık %60'ıdır. Bu nedenle, kumamotoamid 1'in özelliklerini ayrıntılı olarak incelemeye karar verdik.
Coumamonamide 1 beyaz amorf bir tozdur ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRESIMS) C6H8N2O2'yi doğrular (Şekil 1). Bu bileşiğin C2-ikameli pirol parçası δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR spektrumunda δH: 4.5 Hz, H-5) ve δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ile karakterize edilir ve 13C NMR spektrumu dört sp2 karbon atomunun varlığını gösterir. C2 pozisyonunda bir amid grubunun varlığı, C-3 protonundan δC 161.1'deki amid karbonil karbonuna HMBC korelasyonu ile değerlendirildi. Ek olarak, δH 4.10 (3H, S) ve δC 68.3'teki 1 H ve 13 C NMR tepeleri molekülde N-metoksi gruplarının varlığını gösterir. Metoksi grubunun doğru pozisyonu henüz geliştirilmiş fark spektroskopisi ve nükleer Overhauser kısaltması (NOEDF) gibi spektroskopik analiz kullanılarak belirlenmemiş olsa da, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid ilk aday bileşik oldu.
1'in doğru yapısını belirlemek için toplam bir sentez gerçekleştirildi (Şekil 2a). Ticari olarak temin edilebilen 2-aminopiridin 2'nin m-CPBA ile muamelesi, kantitatif verimle karşılık gelen N-oksit 3 ile sonuçlandı. 2'nin 2-aminoazidasyonundan sonra, Abramovich tarafından açıklanan siklokondenzasyon reaksiyonu, istenen 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5'i gram olarak elde etmek için 90 °C'de benzen içinde gerçekleştirildi. Hız %60 (iki aşama). 15,16. 4'ün metilasyonu ve hidrolizi daha sonra iyi bir verimle (%70, iki aşama) 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik asit (“kumotonik asit” olarak adlandırılır, 6) verdi. Son olarak, sulu amonyak kullanılarak asit klorür ara maddesi 6 yoluyla amidasyon, %98 verimle Kumamoto amidi 1'i verdi. Sentezlenen 1'in tüm spektral verileri izole edilen 1'e benzediğinden 1'in yapısı belirlendi;
Urbenamid ve urbenik asidin biyolojik aktivitesinin genel sentezi ve analizi. (a) Kumamoto amidinin toplam sentezi. (b) Yedi günlük yabani tip Arabidopsis Columbia (Col) fideleri, belirtilen konsantrasyonlarda coumamonamid 6 veya coumamonamid 1 içeren Murashige ve Skoog (MS) plakalarında yetiştirildi. Ölçek çubuğu = 1 cm.
Öncelikle, urbenamid ve ara ürünlerinin bitki büyümesini düzenleme yetenekleri açısından biyolojik aktivitelerini değerlendirdik. MS agar ortamına çeşitli konsantrasyonlarda ursmonamid 1 veya ursmonik asit 6 ekledik ve bu ortamda Arabidopsis thaliana fideleri kültüre aldık. Bu analizler, 6'nın yüksek konsantrasyonlarının (500 μM) kök büyümesini engellediğini gösterdi (Şekil 2b). Daha sonra, 6'nın N1 pozisyonunu değiştirerek çeşitli türevler ürettik ve bunlar üzerinde yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları gerçekleştirdik (analog sentez süreci Destekleyici Bilgilerde (SI) açıklanmıştır). Arabidopsis fideleri 50 μM ursonik asit türevleri içeren bir ortamda büyütüldü ve kök uzunluğu ölçüldü. resimde gösterildiği gibi. Şekil 3a, b ve S1'de gösterildiği gibi, coumamo asitleri N1 pozisyonunda farklı uzunluklarda doğrusal alkoksi zincirlerine (9, 10, 11, 12 ve 13) veya büyük alkoksi zincirlerine (15, 16 ve 17) sahiptir. Türevler kök büyümesinin önemli ölçüde engellendiğini gösterdi. Ek olarak, 200 μM 10, 11 veya 17 uygulamasının çimlenmeyi engellediğini bulduk (Şekil 3c ve S2).
Kumamoto amidinin ve ilgili bileşiklerin yapı-aktivite ilişkisinin incelenmesi. (a) Analogların yapı ve sentez şeması. (b) 50 μM kumaronamid türevleriyle veya türevleri olmadan MS ortamında yetiştirilen 7 günlük fidelerin kök uzunluğunun kantifikasyonu. Yıldızlar, sahte tedaviyle önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>18. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. nt, tohumların %50'sinden fazlası çimlenmediği için "test edilmedi" anlamına gelir. (c) 200 μM kumaronamid ve ilgili bileşiklerle veya bunlar olmadan MS ortamında 7 gün inkübe edilen işlenmiş tohumların çimlenme oranının kantifikasyonu. Yıldızlar, sahte tedaviyle önemli farklılıklar olduğunu gösterir (ki-kare testi). n=96.
İlginç bir şekilde, C9'dan daha uzun alkil yan zincirlerinin eklenmesi inhibitör aktiviteyi azalttı; bu da kumamotoik asitle ilişkili bileşiklerin biyolojik aktivitelerini gösterebilmeleri için belirli büyüklükte yan zincirlere ihtiyaç duyduklarını düşündürmektedir.
Yapı-aktivite ilişkisi analizi C9'un üronik aside dönüştürüldüğünü ve üronik asidin noniloksi türevinin (bundan sonra KAND 11 olarak anılacaktır) en etkili bitki büyüme inhibitörü olduğunu gösterdiğinden, KAND 11'in daha ayrıntılı bir karakterizasyonunu gerçekleştirdik. Arabidopsis'in 50 μM KAND 11 ile muamele edilmesi çimlenmeyi neredeyse tamamen engelledi, buna karşın daha düşük konsantrasyonlarda (40, 30, 20 veya 10 μM) KAND 11 kök büyümesini doza bağlı bir şekilde engelledi (Şekil 4a, b). KAND 11'in kök meristem canlılığını etkileyip etkilemediğini test etmek için, propidyum iyodür (PI) ile boyanmış kök meristemlerini inceledik ve meristem alan boyutunu ölçtük. 25 μM KAND-11 içeren bir ortamda yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 151,1 ± 32,5 μm iken, DMSO içeren bir kontrol ortamında yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 264,7 ± 30,8 μm idi (Şekil 4c, d), bu da KAND-11'in hücresel aktiviteyi geri kazandırdığını göstermektedir. yayılma. Kök meristemi. Bununla tutarlı olarak, KAND 11 tedavisi kök meristemindeki hücre bölünme belirteci CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyalinin miktarını azalttı (Şekil 4e) 17 . Bu sonuçlar, KAND 11'in hücre çoğalma aktivitesini azaltarak kök büyümesini engellediğini göstermektedir.
Urbenonik asit türevlerinin (urbeniloksi türevleri) büyüme üzerindeki inhibitör etkisinin analizi. (a) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarına sahip MS plakalarında yetiştirilen 7 günlük yabani tip Col fideleri. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Kök uzunluğunun kantifikasyonu. Harfler önemli farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05).n>16. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. (c) 25 μM KAND ile veya olmadan MS plakalarında yetiştirilen propidyum iyodürle boyanmış vahşi tip Col köklerinin konfokal mikroskobu 11. Beyaz parantezler kök meristemlerini gösterir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (d) Kök meristem boyutunun kantifikasyonu (n = 10 ila 11). İstatistiksel farklar t-testi kullanılarak belirlendi (p< 0,05). Çubuklar ortalama meristem boyutunu temsil eder. (e) CDKB2 yapısını içeren bir kök meristeminin diferansiyel interferans kontrast (DIC) mikroskobu; 1pro: CDKB2; 1-GUS boyanmış ve 25 µM KAND testiyle veya testi olmadan MS plakalarında yetiştirilen 5 günlük fideler üzerinde boyanmıştır.
KAND 11'in fitotoksisitesi, başka bir dikotiledon bitki olan tütün (Nicotiana tabacum) ve önemli bir kara bitkisi model organizması olan ciğer otu (Marchantia polymorpha) kullanılarak daha ileri düzeyde test edildi. Arabidopsis'te olduğu gibi, 25 μM KAND 11 içeren ortamda yetiştirilen tütün SR-1 fideleri daha kısa kökler üretti (Şekil 5a). Ayrıca, 48 tohumdan 40'ı 200 μM KAND 11 içeren plakalarda çimlenirken, 48 tohumun tamamı sahte işlem görmüş ortamlarda çimlendi; bu da daha yüksek KAND konsantrasyonlarının önemli olduğunu göstermektedir (p< 0,05; ki testi -kare) tütünün çimlenmesini engelledi. (Şekil 5b). Ayrıca, ciğer otunda bakteri büyümesini engelleyen KAND 11 konsantrasyonu, Arabidopsis'teki etkili konsantrasyona benzerdi (Şekil 5c). Bu sonuçlar, KAND 11'in çeşitli bitkilerin büyümesini engelleyebileceğini göstermektedir. Daha sonra, sırasıyla daha yüksek hayvan ve bakteri hücrelerinin temsilcileri olarak insan HeLa hücreleri ve Escherichia coli suşu DH5α olmak üzere diğer organizmalarda ayı monoamidiyle ilişkili bileşiklerin olası sitotoksisitesini araştırdık. Bir dizi hücre çoğalma deneyinde, kumamonamid 1, kumamonamidik asit 6 ve KAND 11'in 100 μM konsantrasyonlarda HeLa veya E. coli hücrelerinin büyümesini etkilemediğini gözlemledik (Şekil 5d,e).
Arabidopsis dışı organizmalarda KAND 11'in büyüme inhibisyonu. (a) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 25 μM KAND 11 içeren dikey konumlandırılmış MS plakalarında büyütüldü. (b) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 200 μM KAND 11 içeren yatay konumlandırılmış MS plakalarında büyütüldü. (c) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarına sahip Gamborg B5 plakalarında büyütülen iki haftalık yabani tip Tak-1 karaciğer otu tomurcukları. Kırmızı oklar, iki haftalık inkübasyon süresi içinde büyümeyi durduran sporları göstermektedir. (d) HeLa hücrelerinin hücre çoğalma testi. Canlı hücre sayısı, hücre sayım kiti 8 (Dojindo) kullanılarak sabit zaman aralıklarında ölçüldü. Kontrol olarak, HeLa hücreleri RNA polimeraz transkripsiyonunu inhibe eden ve hücre ölümüne neden olan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D) ile muamele edildi. Analizler üçlü olarak gerçekleştirildi. (e) E. coli hücre çoğalma testi. E. coli büyümesi OD600 ölçülerek analiz edildi. Kontrol olarak, hücreler bakteriyel hücre duvarı sentezini inhibe eden 50 μg/ml ampisilin (Amp) ile muamele edildi. Analizler üçlü olarak gerçekleştirildi.
Uramid ile ilişkili bileşiklerin neden olduğu sitotoksisitenin etki mekanizmasını çözmek için, orta düzeyde inhibitör etkiye sahip urbenik asit türevlerini resimde gösterildiği gibi yeniden analiz ettik. Şekil 2b, 6a'da gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda (200 μM) urmotonik asit 6 içeren agar plakalarında yetiştirilen fideler daha kısa ve sola doğru kıvrık kökler üretti (θ = – 23,7 ± 6,1), kontrol ortamında yetiştirilen fidelerde ise neredeyse düz kökler üretti (θ = – 3,8 ± 7,1). Bu karakteristik eğik büyümenin kortikal mikrotübüllerin işlev bozukluğundan kaynaklandığı bilinmektedir14,18. Bu bulguyla tutarlı olarak, mikrotübül dengesizleştirici ilaçlar disopiramid ve orizalin, büyüme koşullarımızda benzer kök eğilmesine neden oldu (Şekil 2b, 6a). Aynı zamanda, urmotonik asit türevlerini test ettik ve bunlardan belirli konsantrasyonlarda eğik kök büyümesini indükleyen birkaçını seçtik. Bileşikler 8, 9 ve 15, sırasıyla 75 μM, 50 μM ve 40 μM'de kök büyümesinin yönünü değiştirdi ve bu bileşiklerin mikrotübülleri etkili bir şekilde dengesizleştirebileceğini gösterdi (Şekil 2b, 6a). Ayrıca, en güçlü ursolik asit türevi olan KAND 11'i daha düşük bir konsantrasyonda (15 µM) test ettik ve KAND 11 uygulamasının kök büyümesini engellediğini ve kök büyüme yönünün sola doğru eğimli olmalarına rağmen düzensiz olduğunu bulduk (Şekil C3). . Mikrotübül dengesizleştirici ilaçların daha yüksek konsantrasyonları bazen kök eğilmesine neden olmaktan çok bitki büyümesini engellediğinden, daha sonra kök epidermal hücrelerindeki kortikal mikrotübülleri gözlemleyerek KAND 11'in mikrotübülleri etkileme olasılığını değerlendirdik. 25 μM KAND 11 ile muamele edilen fide köklerinin epidermal hücrelerinde anti-β-tubulin antikorları kullanılarak yapılan immünohistokimya, uzama bölgesindeki epidermal hücrelerde neredeyse tüm kortikal mikrotübüllerin kaybolduğunu gösterdi (Şekil 6b). Bu sonuçlar, kumamotonik asit ve türevlerinin mikrotübüller üzerinde doğrudan veya dolaylı olarak etki ederek onları parçaladığını ve bu bileşiklerin yeni mikrotübül inhibitörleri olduğunu göstermektedir.
Ursonik asit ve türevleri, Arabidopsis thaliana'daki kortikal mikrotübülleri değiştirir. (a) Belirtilen konsantrasyonlarda çeşitli urmotonik asit türevlerinin varlığında ölçülen kök eğim açısı. Mikrotübülleri inhibe ettiği bilinen iki bileşiğin etkileri: disopiramid ve orizalin de analiz edildi. Ekte kök büyüme açısını ölçmek için kullanılan standart gösterilmektedir. Yıldız işaretleri, sahte tedaviyle önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>19. Ölçek çubuğu = 1 cm. (b) Uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüller. 25 μM KAND 11 ile veya bunlar olmadan MS plakalarında yetiştirilen yabani tip Arabidopsis Col köklerindeki mikrotübüller, β-tubulin birincil antikorları ve Alexa Flor konjuge ikincil antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal boyama ile görüntülendi. Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Kök meristemindeki mikrotübüllerin mitotik yapısı. Mikrotübüller immünohistokimyasal boyama kullanılarak görüntülendi. Profaz bölgeleri, iğcikler ve fragmoplastlar dahil olmak üzere mitotik yapılar konfokal görüntülerden sayıldı. Oklar mitotik mikrotübül yapılarını göstermektedir. Yıldız işaretleri sahte tedavi ile önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (t testi, p< 0,05).n>9. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Ursa mikrotübül fonksiyonunu bozma yeteneğine sahip olsa da, etki mekanizmasının tipik mikrotübül depolimerize edici ajanlardan farklı olması beklenmektedir. Örneğin, disopiramid ve orizalin gibi mikrotübül depolimerize edici ajanların daha yüksek konsantrasyonları epidermal hücrelerin anizotropik genişlemesini indüklerken, KAND 11 bunu yapmaz. Ek olarak, KAND 11 ve disopiramidin birlikte uygulanması, disopiramid kaynaklı birleşik bir kök büyüme tepkisi ile sonuçlandı ve KAND 11 kaynaklı büyüme inhibisyonu gözlemlendi (Şekil S4). Ayrıca, aşırı duyarlı disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11'e tepkisini de analiz ettik. phs1-1, kanonik olmayan bir tubulin kinaz nokta mutasyonuna sahiptir ve disopiramid ile muamele edildiğinde daha kısa kökler üretir9,20. KAND 11 içeren agar ortamında yetiştirilen phs1-1 mutant fideleri, disopiramid üzerinde yetiştirilenlere benzer şekilde daha kısa köklere sahipti (Şekil S5).
Ayrıca, KAND 11 ile muamele edilen fidelerin kök meristeminde profaz bölgeleri, iğ iplikleri ve fragmoplastlar gibi mitotik mikrotübül yapıları gözlemledik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS için yapılan gözlemlerle tutarlı olarak, mitotik mikrotübül sayısında önemli bir azalma gözlemlendi (Şekil .6c).
KAND 11'in hücre altı çözünürlükteki sitotoksisitesini karakterize etmek için tütün BY-2 süspansiyon hücrelerini KAND 11 ile tedavi ettik ve tepkilerini gözlemledik. İlk olarak, mikrotübülleri floresanla etiketleyen TagRFP-TUA6 ifade eden BY-2 hücrelerine KAND 11 ekleyerek KAND 11'in kortikal mikrotübüller üzerindeki etkisini değerlendirdik. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini ölçen görüntü analizi kullanılarak değerlendirildi. Deney sonuçları, 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile 1 saat tedaviden sonra yoğunluğun sırasıyla %0,94 ± 0,74 veya %0,23 ± 0,28'e önemli ölçüde azaldığını, DMSO ile tedavi edilen hücrelerin yoğunluğunun ise %1,61 ± 0,34'e ulaştığını gösterdi (Şekil 7a). Bu sonuçlar, KAND 11 tedavisinin kortikal mikrotübüllerin depolimerizasyonunu indüklediğine dair Arabidopsis'teki gözlemle tutarlıdır (Şekil 6b). Aynı konsantrasyonda KAND 11 ile tedaviden sonra GFP-ABD etiketli aktin filamentleri ile BY-2 hattını da inceledik ve KAND 11 tedavisinin aktin filamentlerini bozduğunu gözlemledik. 1 saat boyunca 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile tedavi, aktin filament yoğunluğunu sırasıyla %1,20 ± 0,62 veya %0,61 ± 0,26'ya önemli ölçüde düşürürken, DMSO ile tedavi edilen hücrelerdeki yoğunluk %1,69 ± 0,51 idi (Şekil 2). 7b). Bu sonuçlar, aktin filamentlerini etkilemeyen propizamidin ve mikrotübülleri etkilemeyen bir aktin depolimerizatörü olan latrunculin B'nin etkileriyle çelişmektedir (SI Şekil S6). Ek olarak, coumamonamid 1, coumamonamid asit 6 veya KAND 11 ile tedavi HeLa hücrelerindeki mikrotübülleri etkilemedi (SI Şekil S7). Bu nedenle, KAND 11'in etki mekanizmasının bilinen sitoskeleton bozucularınkinden farklı olduğuna inanılmaktadır. Ek olarak, KAND 11 ile tedavi edilen BY-2 hücrelerinin mikroskobik gözlemimiz, KAND 11 tedavisi sırasında hücre ölümünün başladığını ortaya koydu ve Evans mavisi boyalı ölü hücrelerin oranının 30 dakikalık KAND 11 tedavisinden sonra önemli ölçüde artmadığını, buna karşın 50 μM veya 100 μM KAND ile 90 dakikalık tedaviden sonra ölü hücre sayısının sırasıyla %43,7 veya %80,1'e yükseldiğini gösterdi (Şekil 7c). Birlikte ele alındığında, bu veriler yeni ursolik asit türevi KAND 11'in daha önce bilinmeyen bir etki mekanizmasına sahip bitkiye özgü bir sitoskeletal inhibitör olduğunu göstermektedir.
KAND, kortikal mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve tütün BY-2 hücrelerinin canlılığını etkiler. (a) TagRFP-TUA6 varlığında BY-2 hücrelerinde kortikal mikrotübüllerin görüntülenmesi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile tedavi edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal mikrotübül yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler önemli farklılıkları gösterir (Tukey HSD testi, p< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (b) GFP-ABD2 varlığında görüntülenen BY-2 hücrelerindeki kortikal aktin filamentleri. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile tedavi edilen BY-2 hücreleri konfokal mikroskopi ile incelendi. Kortikal aktin filamentlerinin yoğunluğu 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı. Harfler önemli farklılıkları gösterir (Tukey HSD testi, p< 0,05). Ölçek çubuğu = 10 µm. (c) Evans mavi boyama ile ölü BY-2 hücrelerinin gözlemlenmesi. KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile tedavi edilen BY-2 hücreleri parlak alan mikroskobu ile incelendi. n=3. Ölçek çubuğu = 100 µm.
Yeni doğal ürünlerin keşfi ve uygulanması, tıp ve tarım dahil olmak üzere insan yaşamının çeşitli yönlerinde önemli ilerlemelere yol açmıştır. Doğal kaynaklardan yararlı bileşikler elde etmek için tarihi araştırmalar yürütülmüştür. Özellikle, aktinomisetlerin, ivermektinin ve bleomisin ve türevlerinin öncü bileşiği olan avermektin gibi çeşitli ikincil metabolitleri üretme kabiliyetleri nedeniyle nematodlar için antiparaziter antibiyotikler olarak yararlı oldukları bilinmektedir ve bunlar tıbbi olarak antikanser ajanı olarak kullanılır21,22. Benzer şekilde, aktinomisetlerden çeşitli herbisit bileşikleri keşfedilmiştir ve bunlardan bazıları halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır1,23. Bu nedenle, istenen biyolojik aktivitelere sahip doğal ürünleri izole etmek için aktinomiset metabolitlerinin analizi etkili bir strateji olarak kabul edilir. Bu çalışmada, S. werraensis'ten yeni bir bileşik olan coumamonamide keşfettik ve bunu başarıyla sentezledik. Ursonik asit, urbenamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesidir. Karakteristik kök kıvrılmasına neden olabilir, orta ila güçlü herbisit aktivitesi gösterebilir ve doğrudan veya dolaylı olarak bitki mikrotübüllerine zarar verebilir. Ancak, urmotonik asidin etki mekanizması mevcut mikrotübül inhibitörlerinden farklı olabilir, çünkü KAND 11 ayrıca aktin filamentlerini bozar ve hücre ölümüne neden olur, bu da urmotonik asit ve türevlerinin çok çeşitli sitoskeletal yapıları etkilediği düzenleyici bir mekanizma olduğunu düşündürmektedir.
Urbenonik asidin daha ayrıntılı karakterizasyonu, urbenonik asidin etki mekanizmasını daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Özellikle, bir sonraki hedef, ursonik asidin indirgenmiş mikrotübüllere bağlanma yeteneğini değerlendirmek ve ursonik asit ve türevlerinin mikrotübüller üzerinde doğrudan etki edip etmediğini ve onları depolimerize edip etmediğini veya etkilerinin mikrotübül destabilizasyonuna yol açıp açmadığını belirlemektir. Ek olarak, mikrotübüllerin doğrudan hedef olmadığı durumda, ursonik asidin bitki hücreleri üzerindeki etki yerini ve moleküler hedeflerini belirlemek, ilgili bileşiklerin özelliklerini ve herbisit aktivitesini iyileştirmenin olası yollarını daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Biyoaktivite denememiz, ursonik asidin Arabidopsis thaliana, tütün ve ciğer otu gibi bitkilerin büyümesi üzerindeki benzersiz sitotoksik yeteneğini ortaya koyarken, ne E. coli ne de HeLa hücreleri etkilenmedi. Hayvan hücrelerine karşı çok az veya hiç toksisite olmaması, açık tarım alanlarında kullanılmak üzere herbisit olarak geliştirilirlerse ursonik asit türevlerinin bir avantajıdır. Gerçekten de, mikrotübüller ökaryotlarda yaygın yapılar olduğundan, bitkilerde seçici inhibisyonları herbisitler için temel bir gerekliliktir. Örneğin, doğrudan tubuline bağlanan ve polimerizasyonu engelleyen bir mikrotübül depolimerizasyon maddesi olan propizamid, hayvan hücrelerine karşı düşük toksisitesi nedeniyle bir herbisit olarak kullanılır24. Disopiramidin aksine, ilgili benzamidler farklı hedef özgüllüklerine sahiptir. Bitki mikrotübüllerine ek olarak, RH-4032 veya benzoksamid de sırasıyla hayvan hücrelerinin veya oomisitlerin mikrotübüllerini inhibe eder ve zalilamid düşük fitotoksisitesi nedeniyle bir mantar ilacı olarak kullanılır25,26,27. Yeni keşfedilen ayı ve türevleri bitkilere karşı seçici sitotoksisite gösterir, ancak daha fazla modifikasyonun hedef özgüllüğünü değiştirebileceğini ve potansiyel olarak patojenik mantarların veya oomisitlerin kontrolü için ek türevler sağlayabileceğini belirtmekte fayda vardır.
Urbenonik asit ve türevlerinin benzersiz özellikleri, herbisitler olarak geliştirilmeleri ve araştırma araçları olarak kullanılmaları için faydalıdır. Bitki hücre şeklini kontrol etmede sitoskeletonun önemi yaygın olarak kabul edilmektedir. Daha önceki çalışmalar, bitkilerin morfogenezi uygun şekilde kontrol etmek için mikrotübül dinamiklerini kontrol ederek kortikal mikrotübül organizasyonunun karmaşık mekanizmalarını geliştirdiğini göstermiştir. Mikrotübül aktivitesinin düzenlenmesinden sorumlu çok sayıda molekül tanımlanmıştır ve ilgili araştırmalar hala devam etmektedir3,4,28. Bitki hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerine ilişkin mevcut anlayışımız, kortikal mikrotübül organizasyonunun mekanizmalarını tam olarak açıklamamaktadır. Örneğin, hem disopiramid hem de orizalin mikrotübülleri depolimerize edebilmesine rağmen, disopiramid ciddi kök bozulmasına neden olurken, orizalin nispeten hafif bir etkiye sahiptir. Dahası, mikrotübülleri stabilize eden tubulindeki mutasyonlar da köklerde dekstrorotasyona neden olurken, mikrotübül dinamiklerini de stabilize eden paklitaksel neden olmaz. Bu nedenle, ursolik asidin moleküler hedeflerinin incelenmesi ve tanımlanması, bitki korteks mikrotübüllerinin düzenlenmesine ilişkin yeni bakış açıları sağlamalıdır. Benzer şekilde, disopiramid gibi çarpık büyümeyi teşvik etmede etkili olan kimyasalların ve orizalin veya kumamotorik asit gibi daha az etkili kimyasalların gelecekteki karşılaştırmaları, çarpık büyümenin nasıl meydana geldiğine dair ipuçları sağlayacaktır.
Öte yandan, savunmayla ilişkili sitoskeletal yeniden düzenlemeler, ursonik asidin sitotoksisitesini açıklamak için başka bir olasılıktır. Bir patojenin enfeksiyonu veya bir uyarıcının bitki hücrelerine sokulması bazen sitoskeletonun tahribatına ve ardından hücre ölümüne neden olur29. Örneğin, oomisitten türetilen kriptoksantinin, KAND tedavisinde meydana gelenlere benzer şekilde, tütün hücre ölümünden önce mikrotübülleri ve aktin filamentlerini bozduğu bildirilmiştir30,31. Ursonik asit tarafından indüklenen savunma tepkileri ile hücresel tepkiler arasındaki benzerlikler, bunların ortak hücresel süreçleri tetiklediği hipotezini öne sürmemize yol açtı, ancak kriptoksantinden daha hızlı ve daha güçlü bir ursonik asit etkisi açıktır. Bununla birlikte, çalışmalar aktin filamentlerinin bozulmasının, her zaman mikrotübül bozulmasıyla birlikte olmayan kendiliğinden hücre ölümünü teşvik ettiğini göstermiştir29. Ek olarak, patojenin veya uyarıcının, ursonik asit türevlerinin yaptığı gibi, çarpık kök büyümesine neden olup olmadığı henüz görülmemiştir. Bu nedenle, savunma tepkilerini ve sitoskeletonu birbirine bağlayan moleküler bilgi, ele alınması gereken çekici bir sorundur. Ursonik asitle ilişkili düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerin ve çeşitli potansiyellere sahip bir dizi türevin varlığından yararlanılarak, bilinmeyen hücresel mekanizmaları hedefleme fırsatları sağlanabilir.
Birlikte ele alındığında, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen yeni bileşiklerin keşfi ve uygulanması, bitki hücre şekli belirlemesinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmaları ele almak için güçlü yöntemler sağlayacaktır. Bu bağlamda, mikrotübülleri ve aktin filamentlerini etkileyen ve hücre ölümünü indükleyen yakın zamanda geliştirilen bileşik urmotonik asit, mikrotübül kontrolü ile bu diğer mekanizmalar arasındaki bağlantıyı deşifre etmek için bir fırsat sağlayabilir. Bu nedenle, urbenonik asit kullanılarak yapılan kimyasal ve biyolojik analiz, bitki sitoskeletonunu kontrol eden moleküler düzenleyici mekanizmaları anlamamıza yardımcı olacaktır.
S. werraensis MK493-CF1'i, %2 (w/v) galaktoz, %2 (w/v) Esans ezmesi, %1 (w/v) Bacto bileşiminden oluşan 110 mL tohum ortamı içeren 500 mL bölmeli bir Erlenmeyer şişesine aşılayın. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), %0,5 (w/v) mısır özü (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), %0,2 (w/v) (NH4)2SO4 ve %0,2 CaCO3 deiyonize suda. (sterilizasyondan önce pH 7,4). Tohum kültürleri 27°C'de döner bir çalkalayıcıda (180 rpm) 2 gün inkübe edildi. Katı hal fermantasyonu yoluyla üretim yetiştirme. Tohum kültürü (7 ml), 15 g preslenmiş arpa (MUSO Co., Ltd., Japonya) ve 25 g deiyonize sudan (sterilizasyondan önce pH ayarlanmamış) oluşan 40 g üretim ortamı içeren 500 ml'lik bir K-1 şişesine aktarıldı. Fermantasyon, karanlıkta 30 °C'de 14 gün boyunca gerçekleştirildi. Fermantasyon materyali 40 ml/şişe EtOH ile çıkarıldı ve santrifüj edildi (1500 g, 4 °C, 10 dakika). Kültür üst sıvısı (60 ml), %10 MeOH/EtOAc karışımı ile çıkarıldı. Organik katman, bir kalıntı (59,5 mg) elde etmek için azaltılmış basınç altında buharlaştırıldı ve bu kalıntı, ters faz kolonunda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × uzunluk 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 dakika: %90 H2O/CH3CN ila %70 H2O/CH3CN (gradyan), 35–45 dakika: %90 H2O/EtOH, 45–155 dakika: %90 H2O/EtOH ila %100 EtOH (gradyan (gradyan), 155–200 dak: %100 EtOH) 1,5 ml/dak akış hızında HPLC'ye tabi tutuldu, kumaronamid (1, 36,0 mg) beyaz amorf bir toz halinde izole edildi.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesaplanan değer: 141.0659, ölçülen değer: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia tohumları (Col-0) araştırma amaçlı kullanım için izin alınarak Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi'nden (ABRC) temin edildi. Col-0 tohumları laboratuvar koşullarımızda çoğaltıldı ve muhafaza edildi ve yabani tip Arabidopsis bitkileri olarak kullanıldı. Arabidopsis tohumları yüzey sterilizasyonuna tabi tutuldu ve %2 sakaroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), %0,05 (w/v) 2-(4-morpholino)etansülfonik asit (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı kuvvetli Murashige ve Skoog besiyerinde ve %1,5 agarda (Fujifilm Wako Pure Chemical) kültüre edildi, pH 5,7, 23 °C'de ve sabit ışıkta. phs1-1 mutantının tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı.
SR-1 suşunun tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı ve yabani tip tütün bitkisi olarak kullanıldı. Tütün tohumları yüzeysel olarak sterilize edildi ve çimlenmeyi teşvik etmek için üç gece boyunca steril suda bekletildi, ardından %2 sakaroz, %0,05 (ağırlık/hacim) MES ve %0,8 gellan zamkı (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige içeren yarı kuvvetli bir çözeltiye yerleştirildi. ve Skoog ortamı) pH 5,7'de ve sabit ışık altında 23°C'de inkübe edildi.
Tak-1 suşu T. Kohchi (Kyoto Üniversitesi) tarafından sağlandı ve karaciğer otu çalışması için standart deneysel birim olarak kullanıldı. Gemma, sterilize edilmiş kültür bitkilerinden elde edildi ve daha sonra %1 sakaroz ve %0,3 gellan zamkı içeren Gamborg B5 ortamına (Fujifilm Wako Pure Chemical) plakalandı ve sürekli ışık altında 23°C'de inkübe edildi.
Tütün BY-2 hücreleri (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlandı. BY-2 hücreleri modifiye Linsmeier ve Skoog ortamında 95 kat seyreltildi ve haftalık olarak 2,4-diklorofenoksiasetik asit 32 ile desteklendi. Hücre süspansiyonu karanlıkta 27°C'de 130 rpm'de döner bir çalkalayıcıda karıştırıldı. Hücreleri taze ortamın hacminin 10 katı ile yıkayın ve aynı ortamda tekrar süspanse edin. Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü altında mikrotübül işaretleyicisi TagRFP-TUA6 veya aktin filament işaretleyicisi GFP-ABD2'yi stabil şekilde ifade eden BY-2 transgenik hücre hatları açıklandığı gibi üretildi33,34,35. Bu hücre hatları, orijinal BY-2 hücre hattı için kullanılanlara benzer prosedürler kullanılarak korunabilir ve senkronize edilebilir.
HeLa hücreleri, %10 fetal dana serumu, 1,2 U/ml penisilin ve 1,2 μg/ml streptomisin eklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) (Life Technologies) %5 CO2 içeren 37°C'lik bir inkübatörde kültüre edildi.
Bu yazıda anlatılan tüm deneyler Japon biyogüvenlik yönetmeliklerine ve yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
Bileşikler stok çözeltiler olarak dimetil sülfoksit (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) içinde çözüldü ve Arabidopsis ve tütün için MS besiyerinde veya ciğer otu için Gamborg B5 besiyerinde seyreltildi. Kök büyüme inhibisyon testi için, plaka başına 10'dan fazla tohum belirtilen bileşikleri veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Tohumlar 7 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi. Fideler fotoğraflandı ve köklerin uzunluğu ölçüldü. Arabidopsis çimlenme testi için, plaka başına 48 tohum 200 μM bileşik veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Arabidopsis tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve çimlenen fide sayısı çimlenmeden 7 gün sonra (dag) sayıldı. Tütün çimlenme testi için, plaka başına 24 tohum 200 μM KAND veya DMSO içeren agar besiyerine ekildi. Tütün tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve çimlenen fide sayısı 14 gün sonra sayıldı. Karaciğer otu büyüme inhibisyon testi için her plakadan 9 embriyo, belirtilen konsantrasyonlarda KAND veya DMSO içeren agar ortamına ekildi ve 14 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi.
Kök meristem organizasyonunu görselleştirmek için 5 mg/ml propidyum iyodür (PI) ile boyanmış fideler kullanın. PI sinyalleri, TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak floresan mikroskobu ile gözlendi.
Köklerin β-glukuronidaz (GUS) ile histokimyasal boyanması Malami ve Benfey36 tarafından açıklanan protokole göre gerçekleştirildi. Fideler bir gece boyunca %90 asetonda fiksasyona tabi tutuldu, 1 saat boyunca GUS tamponunda 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik asit ile boyandı ve hidratlı bir kloraldehit çözeltisine yerleştirildi. (8 g kloral hidrat, 2 ml su ve 1 ml gliserol) ve bir Axio Imager M1 mikroskobu (Carl Zeiss) kullanılarak diferansiyel interferans kontrast mikroskobu ile gözlendi.
Kök açıları, dikey olarak yerleştirilmiş plakalarda yetiştirilen 7 günlük fidelerde ölçüldü. Kök açısını, 6. adımda açıklandığı gibi yerçekimi vektörünün yönünden ölçün.
Kortikal mikrotübüllerin düzenlenmesi, protokol 37'de küçük değişiklikler yapılarak açıklandığı gibi gözlendi. Anti-β-tubulin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ve Alexa Fluor 488-konjuge anti-fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723), sırasıyla 1:1000 ve 1:100 seyreltmelerde birincil ve ikincil antikorlar olarak kullanıldı. Floresan görüntüleri bir TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak elde edildi. Z-yığın görüntüleri elde edin ve üreticinin talimatlarına göre maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.
HeLa hücre proliferasyon testi, üreticinin talimatları doğrultusunda Hücre Sayım Kiti 8 (Dojindo) kullanılarak gerçekleştirildi.
E. coli DH5α'nın büyümesi, 600 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak kültürdeki hücre yoğunluğunun ölçülmesiyle analiz edildi (OD600).
Transgenik BY-2 hücrelerindeki sitoskeletal organizasyon, bir CSU-X1 konfokal tarama cihazı (Yokogawa) ve bir sCMOS kamera (Zyla, Andor Technology) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlendi. Sitoiskelet yoğunluğu, ImageJ yazılımı kullanılarak konfokal görüntülerdeki sitoplazmik pikseller arasındaki sitoskeletal piksellerin yüzdesini ölçen görüntü analizi ile değerlendirildi38,39.
BY-2 hücrelerinde hücre ölümünü tespit etmek için hücre süspansiyonunun bir kısmı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,05 Evans mavisi ile inkübe edildi. Ölü hücrelerin seçici Evans mavisi boyama işlemi, boyanın canlı hücrelerden sağlam plazma membranı tarafından dışarı atılmasına bağlıdır40. Boyanan hücreler parlak alan mikroskobu (BX53, Olympus) kullanılarak gözlendi.
HeLa hücreleri, 37°C ve %5 CO2'de nemli bir inkübatörde %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldü. Hücreler 37°C'de 6 saat boyunca 100 μM KAND 11, kumamonamik asit 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) veya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ile muamele edildi. Hücreler 10 dakika MetOH ile ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika asetat ile sabitlendi. Sabitlenmiş hücreler 0,5% BSA/PBS'de seyreltilmiş β-tubulin birincil antikoru (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ile 2 saat inkübe edildi, TBST ile 3 kez yıkandı ve ardından Alexa Flor keçi antikoru ile inkübe edildi. 488 1 saat. – Fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ve 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), %0,5 BSA/PBS'de seyreltildi. TBST ile üç kez yıkandıktan sonra, boyanmış hücreler Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopta gözlendi. Görüntüler, MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak soğutulmuş bir Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera ile yakalandı.
Gönderi zamanı: 17-Haz-2024