Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır.En iyi sonuçları elde etmek için tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada desteğin sürekliliğini sağlamak için siteyi stil veya JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Doğal ürünlerin keşfi ve faydalı kullanımı insan yaşamının iyileştirilmesine yardımcı olabilir.Bitki büyümesini inhibe eden kimyasallar, yabani otları kontrol etmek için herbisit olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır.Farklı tipteki herbisitlerin kullanılması ihtiyacından dolayı, yeni etki mekanizmalarına sahip bileşiklerin tanımlanmasına ihtiyaç duyulmaktadır.Bu çalışmada Streptomyces werraensis MK493-CF1'den yeni bir N-alkoksipirol bileşiği olan kumaronamidi keşfettik ve sentez sürecini tamamladık.Biyolojik aktivite analizleri yoluyla, urs-monoamik asidin, urs-monoamidin sentetik bir ara ürünü olduğunu ve potansiyel bir ürün olduğunu keşfettik.bitki büyüme inhibitörü.Ek olarak, HeLa hücrelerinin büyümesini olumsuz yönde etkilemeden yüksek herbisidal aktiviteye sahip olan urbeniloksi türevi (UDA) dahil olmak üzere çeşitli urbenonik asit türevleri geliştirdik.Ayrıca ürmotonik asit türevlerinin bitki mikrotübüllerini bozduğunu da bulduk;ayrıca KAND, aktin filamentlerini etkileyerek hücre ölümüne neden olur;Bu çok yönlü etkiler, bilinen mikrotübül inhibitörlerinden farklıdır ve yeni herbisitlerin geliştirilmesinde önemli bir avantajı temsil eden ursonik asit için yeni bir etki mekanizması önermektedir.
Faydalı doğal ürünler ve türevlerinin keşfi ve pratik uygulaması, insan yaşam kalitesini artırmanın bir yoludur.Mikroorganizmalar, bitkiler ve böcekler tarafından üretilen ikincil metabolitler tıp ve tarımda büyük ilerlemelere yol açmıştır.Doğal ürünlerden birçok antibiyotik ve anti-lösemi ilacı geliştirildi.Ayrıca çeşitli türlerdeTarım ilacıBu doğal ürünlerden tarımda kullanılmak üzere fungisitler ve herbisitler elde edilmektedir.Özellikle, yabani ot kontrolü sağlayan herbisitler, modern tarımda mahsul veriminin arttırılması için önemli araçlardır ve çeşitli bileşik türleri halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır.Bitkilerdeki fotosentez, amino asit metabolizması, hücre duvarı sentezi, mitozun düzenlenmesi, fitohormon sinyallemesi veya protein sentezi gibi çeşitli hücresel süreçler, herbisitlerin tipik hedefleri olarak kabul edilir.Mikrotübül fonksiyonunu engelleyen bileşikler, mitotik düzenlemeyi etkileyerek bitki büyümesini etkileyen yaygın bir herbisit sınıfıdır2.
Mikrotübüller hücre iskeletinin bileşenleridir ve ökaryotik hücrelerde geniş ölçüde korunur.Tübülin heterodimeri, silindirik bir yapı oluşturan 13 protofilament ile doğrusal mikrotübül protofilamentleri oluşturan a-tubulin ve β-tubulinden oluşur.Mikrotübüller bitki hücrelerinde hücre şeklinin belirlenmesi, hücre bölünmesi ve hücre içi taşıma3,4 dahil olmak üzere birçok rol oynar.Bitki hücreleri, fazlar arası plazma zarının altında mikrotübüller içerir ve bu sözde kortikal mikrotübüllerin, selüloz sentaz komplekslerinin4,5 düzenlenmesi yoluyla selüloz mikrofibrillerinin organizasyonunu kontrol ettiği düşünülmektedir.Kök ucunun hızlı uzama bölgesinde bulunan kök epidermal hücrelerinin kortikal mikrotübülleri yanal olarak yerleştirilir ve selüloz mikrofiberleri bu mikrotübülleri takip eder ve hücre genişleme yönünü sınırlandırır, böylece anizotropik hücre uzamasını destekler.Bu nedenle mikrotübül fonksiyonu bitki morfolojisi ile yakından ilişkilidir.Tubulini kodlayan genlerdeki amino asit ikameleri, Arabidopsis 6,7'de kortikal mikrotübül dizilerinin eğrilmesine ve sol veya sağ taraflı büyümeye neden olur.Benzer şekilde, mikrotübül dinamiklerini düzenleyen mikrotübül ile ilişkili proteinlerdeki mutasyonlar da çarpık kök büyümesine yol açabilir8,9,10,11,12,13.Ayrıca pretilaklor olarak da bilinen disopiramid gibi mikrotübül bozucu herbisitlerle tedavi de sol taraflı eğik kök büyümesine neden olur14.Bu veriler, mikrotübül fonksiyonunun kesin düzenlemesinin bitki büyüme yönünün belirlenmesinde kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.
Çeşitli mikrotübül inhibitörleri keşfedilmiştir ve bu ilaçlar tarım ve tıbbın yanı sıra hücre iskeleti araştırmalarına da önemli katkılarda bulunmuştur2.Özellikle orizalin, dinitroanilin bileşikleri, disopiramid, benzamid ile ilgili bileşikler ve bunların analogları, mikrotübül fonksiyonunu inhibe edebilir ve dolayısıyla bitki büyümesini inhibe edebilir.Bu nedenle herbisit olarak yaygın şekilde kullanılırlar.Bununla birlikte, mikrotübüller bitki ve hayvan hücrelerinin önemli bir bileşeni olduğundan, mikrotübül inhibitörlerinin çoğu her iki hücre tipi için de sitotoksiktir.Bu nedenle, herbisit olarak bilinen kullanımlarına rağmen, sınırlı sayıda antimikrotübül ajan, pratik amaçlar için kullanılmaktadır.
Streptomyces, aerobik, gram-pozitif, filamentli bakterileri içeren ve çok çeşitli ikincil metabolitler üretme yeteneğiyle yaygın olarak bilinen Streptomyces ailesinin bir cinsidir.Bu nedenle biyolojik olarak aktif yeni doğal ürünlerin en önemli kaynaklarından biri olarak kabul edilir.Bu çalışmada, Streptomyces werraensis MK493-CF1 ve S. werraensis ISP 5486'dan izole edilen kumaronamid adı verilen yeni bir bileşik keşfettik. Spektral analiz ve tam spektral analiz kullanılarak kumaronamidin yapısı karakterize edildi ve benzersiz N-alkoksipirol iskeleti saptanmıştır.sentez.Ursmonoamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesi olan Ursmonik asidin, popüler model bitki Arabidopsis thaliana'nın büyümesini ve çimlenmesini engellediği bulundu.Bir yapı-aktivite ilişkisi çalışmasında, ursonik asitin noniloksi türevi (KAND) olarak adlandırılan, ursonik asit olarak değiştirilmiş C9'lu bir bileşiğin, büyüme ve çimlenme üzerindeki engelleyici etkiyi önemli ölçüde arttırdığını bulduk.Yeni keşfedilen bitki büyüme inhibitörü, özellikle tütün ve ciğer otunun büyümesini de etkiledi ve bakterilere veya HeLa hücrelerine karşı sitotoksik değildi.Ayrıca bazı ürmotonik asit türevleri, bozuk bir kök fenotipine neden olur; bu da bu türevlerin doğrudan veya dolaylı olarak mikrotübülleri etkilediğini ima eder.Bu fikirle tutarlı olarak, immünohistokimyasal olarak veya floresan proteinlerle etiketlenmiş mikrotübüllere ilişkin gözlemlerimiz, KAND tedavisinin mikrotübülleri depolimerize ettiğini göstermektedir.Ek olarak, kumamotonik asit türevleriyle yapılan muamele, aktin mikrofilamentlerini bozmuştur.Böylece benzersiz etki mekanizması hücre iskeletinin tahrip edilmesini içeren yeni bir bitki büyüme inhibitörü keşfettik.
MK493-CF1 suşu, Tokyo, Shinagawa-ku'daki topraktan izole edildi.MK493-CF1 suşu, iyi dallanmış stromal miselyum oluşturdu.16S ribozomal RNA geninin kısmi dizisi (1422 bp) belirlendi.Bu suş, S. werraensis'e çok benzer (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik suş, %99,93).Bu sonuca göre bu suşun S. werraensis tipi suşla yakından ilişkili olduğu belirlendi.Bu nedenle geçici olarak bu suşu S. werraensis MK493-CF1 olarak adlandırdık.S. werraensis ISP 5486T de aynı biyoaktif bileşikleri üretir.Bu mikroorganizmadan doğal ürünler elde etmeye yönelik ilk araştırmalar çok az olduğundan, daha ileri kimyasal araştırmalar yapıldı.S. werraensis MK493-CF1'in arpa ortamı üzerinde 30°C'de 14 gün boyunca katı hal fermantasyonu yoluyla yetiştirilmesinden sonra ortamın özü, %50 EtOH ile çıkarıldı.60 ml numune kurutularak 59.5 mg ham ekstrakt elde edildi.Ham ekstre, N-metoksi-1 H-pirol-2-karboksamit (1, kumaronamid olarak adlandırılır, 36.0 mg) verecek şekilde ters fazlı HPLC'ye tabi tutuldu.Toplam 1 miktarı ham ekstraktın yaklaşık %60'ıdır.Bu nedenle kumamotoamid 1'in özelliklerini detaylı olarak incelemeye karar verdik.
Coumamonamide 1, beyaz amorf bir tozdur ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRESIMS), C6H8N2O2'yi doğrular (Şekil 1).Bu bileşiğin C2-ikameli pirol fragmanı, δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH, 1H NMR spektrumunda: 4,5 Hz) ile karakterize edilir. , H-5) ve δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) ve 13C NMR spektrumu, dört sp2 karbon atomunun varlığını gösterir.C2 pozisyonunda bir amid grubunun varlığı, C-3 protonundan δC 161.1'deki amid karbonil karbona HMBC korelasyonu ile değerlendirildi.Ek olarak, δH 4.10 (3H, S) ve δC 68.3'teki 1H ve13C NMR zirveleri, molekülde N-metoksi gruplarının varlığını gösterir.Metoksi grubunun doğru konumu, gelişmiş fark spektroskopisi ve nükleer Overhauser kısaltması (NOEDF) gibi spektroskopik analiz kullanılarak henüz belirlenmemiş olmasına rağmen, N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid, ilk aday bileşik oldu.
1'in doğru yapısını belirlemek için toplam sentez gerçekleştirildi (Şekil 2a).Ticari olarak temin edilebilen 2-aminopiridin 2'nin m-CPBA ile işlenmesi, niceliksel verimde karşılık gelen N-oksit 3 ile sonuçlandı.2'nin 2-aminoazidasyonundan sonra Abramovich tarafından tarif edilen siklokondensasyon reaksiyonu, gram cinsinden arzu edilen 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5'i elde etmek üzere 90°C'de benzen içerisinde gerçekleştirildi.Hız %60 (iki aşamalı).15,16.Daha sonra 4'ün metilasyonu ve hidrolizi, iyi bir verimle (%70, iki adım) 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik asit ("kumonik asit" olarak adlandırılır, 6) verdi.Son olarak, sulu amonyak kullanılarak asit klorür ara maddesi 6 yoluyla amidasyon, %98 verimle Kumamoto amid 1'i verdi.Sentezlenen 1'in tüm spektral verileri izole edilmiş 1'e benzerdi, dolayısıyla 1'in yapısı belirlendi;
Urbenamid ve urbenik asidin biyolojik aktivitesinin genel sentezi ve analizi.(a) Kumamoto amidinin toplam sentezi.(b) Yedi günlük vahşi tip Arabidopsis Columbia (Col) fideleri, belirtilen konsantrasyonlarda kumaronamid 6 veya kumaronamid 1 içeren Murashige ve Skoog (MS) plakaları üzerinde büyütüldü.Ölçek çubuğu = 1 cm.
İlk olarak, urbenamidin ve ara ürünlerinin biyolojik aktivitelerini bitki büyümesini modüle etme yetenekleri açısından değerlendirdik.MS agar ortamına çeşitli konsantrasyonlarda ursmonamid 1 veya ursmonik asit 6 ekledik ve bu ortamda Arabidopsis thaliana fidelerini kültürledik.Bu analizler, 6'nın yüksek konsantrasyonlarının (500 uM) kök büyümesini inhibe ettiğini gösterdi (Şekil 2b).Daha sonra N1 konumunu 6'ya değiştirerek çeşitli türevler ürettik ve bunlar üzerinde yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları yaptık (analog sentez süreci Destekleyici Bilgilerde (SI) açıklanmıştır).Arabidopsis fideleri, 50 μM ursonik asit türevleri içeren bir ortamda büyütüldü ve kök uzunluğu ölçüldü.resimde gösterildiği gibi.Şekil 3a, b ve S1'de gösterildiği gibi kumamo asitler, N1 pozisyonunda farklı uzunluklarda doğrusal alkoksi zincirlerine (9, 10, 11, 12 ve 13) veya büyük alkoksi zincirlerine (15, 16 ve 17) sahiptir.Türevler kök büyümesinin önemli ölçüde engellendiğini gösterdi.Ek olarak, 200 μM 10, 11 veya 17 uygulamasının çimlenmeyi inhibe ettiğini bulduk (Şekil 3c ve S2).
Kumamoto amid ve ilgili bileşiklerin yapı-aktivite ilişkisinin incelenmesi.(a) Analogların yapısı ve sentez şeması.(b) 50 μM kumaronamid türevleri olsun veya olmasın MS ortamında yetiştirilen 7 günlük fidelerin kök uzunluğunun ölçülmesi.Yıldız işaretleri sahte tedaviyle önemli farklılıkları gösterir (t testi, p< 0,05).n>18. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir.nt "test edilmedi" anlamına gelir çünkü tohumların %50'sinden fazlası çimlenmemiştir.(c) 200 uM kumaronamid ve ilgili bileşiklerle birlikte veya bunlar olmadan MS ortamında 7 gün boyunca inkübe edilen işlenmiş tohumların çimlenme oranının ölçülmesi.Yıldız işaretleri, sahte tedavi (ki-kare testi) ile önemli farklılıkları gösterir.sayı=96.
İlginç bir şekilde, C9'dan daha uzun alkil yan zincirlerin eklenmesi, inhibitör aktiviteyi azalttı; bu da, kumamotoik asitle ilgili bileşiklerin, biyolojik aktivitelerini sergilemek için belirli bir boyutta yan zincirlere ihtiyaç duyduğunu ortaya koydu.
Yapı-aktivite ilişkisi analizi, C9'un ursonik aside modifiye edildiğini ve ursonik asidin noniloksi türevinin (bundan sonra KAND 11 olarak anılacaktır) en etkili bitki büyüme inhibitörü olduğunu gösterdiğinden, KAND 11'in daha ayrıntılı bir karakterizasyonunu gerçekleştirdik. 50 μM KAND 11 ile çimlenme neredeyse tamamen önlenirken, daha düşük konsantrasyonlarda (40, 30, 20 veya 10 μM) KAND 11, doza bağlı bir şekilde kök büyümesini inhibe etti (Şekil 4a, b).KAND 11'in kök meristem canlılığını etkileyip etkilemediğini test etmek için propidyum iyodür (PI) ile boyanmış kök meristemlerini inceledik ve meristem alan boyutunu ölçtük.25 μM KAND-11 içeren bir ortamda yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 151,1 ± 32,5 μm iken, DMSO içeren bir kontrol ortamında yetiştirilen fidelerin meristem boyutu 264,7 ± 30,8 μm idi (Şekil 4c, d) Bu, KAND-11'in hücresel aktiviteyi geri yüklediğini gösterir.yayma.Kök meristemi.Bununla tutarlı olarak KAND 11 tedavisi, kök meristemdeki hücre bölünmesi işaretçisi CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyalinin miktarını azalttı (Şekil 4e)17.Bu sonuçlar KAND 11'in hücre çoğalma aktivitesini azaltarak kök büyümesini engellediğini göstermektedir.
Urbenonik asit türevlerinin (urbeniloksi türevleri) büyüme üzerindeki inhibitör etkisinin analizi.(a) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonlarına sahip MS plakaları üzerinde yetiştirilen 7 günlük yabani tip Col fideleri. Ölçek çubuğu = 1 cm.(b) Kök uzunluğunun ölçülmesi.Harfler önemli farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05).n>16. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir.(c) 25 μM KAND 11 içeren veya içermeyen MS plakalarında büyütülen propidyum iyodür lekeli vahşi tip Col köklerinin konfokal mikroskobu. Beyaz parantezler kök meristemi gösterir.Ölçek çubuğu = 100 µm.(d) Kök meristem boyutunun nicelendirilmesi (n = 10 ila 11).İstatistiksel farklılıklar t-testi kullanılarak belirlendi (p< 0,05).Çubuklar ortalama meristem boyutunu temsil eder.(e) CDKB2 yapısını içeren bir kök meristeminin diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu;1pro: CDKB2;1-GUS, 25 uM KAND tahlili ile veya 25 uM KAND tahlili olmadan MS plakaları üzerinde yetiştirilen 5 günlük fideler üzerinde boyandı ve boyandı.
KAND 11'in fitotoksisitesi başka bir dikotiledon bitki olan tütün (Nicotiana tabacum) ve önemli bir kara bitki modeli organizması olan karaciğer otu (Marchantia polymorpha) kullanılarak ayrıca test edildi.Arabidopsis örneğinde olduğu gibi, 25 uM KAND 11 içeren ortamda yetiştirilen tütün SR-1 fideleri daha kısa kökler üretti (Şekil 5a).Ek olarak, 48 tohumdan 40'ı 200 μM KAND 11 içeren plakalarda çimlenirken, 48 tohumun tamamı sahte işlem görmüş ortamda çimlendi; bu, daha yüksek KAND konsantrasyonlarının anlamlı olduğunu gösterir (p)< 0,05;chi testi -kare) tütünün çimlenmesini engelledi.(Şekil 5b).Ek olarak ciğer otunda bakteri üremesini engelleyen KAND 11 konsantrasyonu, Arabidopsis'teki etkili konsantrasyona benzerdi (Şekil 5c).Bu sonuçlar KAND 11'in çeşitli bitkilerin büyümesini engelleyebileceğini göstermektedir.Daha sonra, sırasıyla daha yüksek hayvan ve bakteri hücrelerinin temsilcileri olarak diğer organizmalardaki, yani insan HeLa hücreleri ve Escherichia coli DH5a suşundaki ayı monoamidiyle ilişkili bileşiklerin olası sitotoksisitesini araştırdık.Bir dizi hücre çoğalması analizinde kumaronamid 1, kumaronamidik asit 6 ve KAND 11'in, 100 μM konsantrasyonlarda HeLa veya E. coli hücrelerinin büyümesini etkilemediğini gözlemledik (Şekil 5d,e).
Arabidopsis olmayan organizmalarda KAND 11'in büyüme inhibisyonu.(a) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, 25 uM KAND 11 içeren dikey olarak konumlandırılmış MS plakaları üzerinde büyütüldü. (b) İki haftalık yabani tip SR-1 tütün fideleri, yatay olarak konumlandırılmış MS plakaları üzerinde büyütüldü 200 μM KAND 11 içeren MS plakaları. (c) Belirtilen KAND 11 konsantrasyonları ile Gamborg B5 plakaları üzerinde büyütülmüş iki haftalık yabani tip Tak-1 ciğer otu tomurcukları. Kırmızı oklar, iki haftalık inkübasyon içinde büyümeyi durduran sporları gösterir. dönem.(d) HeLa hücrelerinin hücre proliferasyon analizi.Canlı hücrelerin sayısı, bir hücre sayma kiti 8 (Dojindo) kullanılarak sabit zaman aralıklarında ölçüldü.Bir kontrol olarak HeLa hücreleri, RNA polimeraz transkripsiyonunu inhibe eden ve hücre ölümüne neden olan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D) ile muamele edildi.Analizler üç kopya halinde gerçekleştirildi.(e) E. coli hücre proliferasyon deneyi.E. coli büyümesi OD600 ölçülerek analiz edildi.Kontrol olarak hücrelere, bakteriyel hücre duvarı sentezini inhibe eden 50 μg/ml ampisilin (Amp) uygulandı.Analizler üç kopya halinde gerçekleştirildi.
Uramile bağlı bileşiklerin neden olduğu sitotoksisitenin etki mekanizmasını çözmek için orta derecede inhibitör etkiye sahip ürbenik asit türevlerini yeniden analiz ettik.resimde gösterildiği gibi.Şekil 2b, 6a'da gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda (200 μM) ürmotonik asit 6 içeren agar plakaları üzerinde yetiştirilen fideler, daha kısa ve sola kavisli kökler (θ = – 23,7 ± 6,1) üretirken, kontrol ortamında yetiştirilen fideler, fideler neredeyse düz kökler üretti (θ = – 3,8 ± 7,1).Bu karakteristik eğik büyümenin kortikal mikrotübüllerin işlev bozukluğundan kaynaklandığı bilinmektedir14,18.Bu bulguyla tutarlı olarak, mikrotübül dengesizleştirici ilaçlar disopiramid ve orizalin, büyüme koşullarımızda benzer kök eğilmesine neden oldu (Şekil 2b, 6a).Aynı zamanda ürmotonik asit türevlerini de test ettik ve bunlardan belirli konsantrasyonlarda eğik kök büyümesine neden olan birkaçını seçtik.Bileşik 8, 9 ve 15, kök büyüme yönünü sırasıyla 75 μM, 50 μM ve 40 μM'de değiştirdi; bu, bu bileşiklerin mikrotübülleri etkili bir şekilde dengesizleştirebildiğini gösterdi (Şekil 2b, 6a).Ayrıca en güçlü ursolik asit türevi olan KAND 11'i daha düşük bir konsantrasyonda (15 µM) test ettik ve KAND 11 uygulamasının kök büyümesini engellediğini ve sola doğru eğim yapma eğiliminde olmasına rağmen kök büyüme yönünün eşitsiz olduğunu bulduk ( Şekil C3)..Mikrotübül istikrarsızlaştırıcı ilaçların daha yüksek konsantrasyonları bazen köklerin eğilmesine neden olmak yerine bitki büyümesini engellediğinden, daha sonra kök epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübülleri gözlemleyerek KAND 11'in mikrotübülleri etkileme olasılığını değerlendirdik.25 uM KAND 11 ile muamele edilmiş fide köklerinin epidermal hücrelerinde anti-β-tubulin antikorları kullanılarak yapılan immünohistokimya, uzama bölgesindeki epidermal hücrelerde neredeyse tüm kortikal mikrotübüllerin kaybolduğunu gösterdi (Şekil 6b).Bu sonuçlar, kumamotonik asit ve türevlerinin doğrudan veya dolaylı olarak mikrotübüller üzerinde etki ederek onları bozduğunu ve bu bileşiklerin yeni mikrotübül inhibitörleri olduğunu göstermektedir.
Ursonik asit ve türevleri, Arabidopsis thaliana'daki kortikal mikrotübülleri değiştirir.(a) Belirtilen konsantrasyonlarda çeşitli ürmotonik asit türevlerinin varlığında ölçülen kök eğim açısı.Mikrotübülleri inhibe ettiği bilinen iki bileşiğin etkileri de analiz edildi: disopiramid ve orizalin.Ekte kök büyüme açısını ölçmek için kullanılan standart gösterilmektedir.Yıldız işaretleri sahte tedaviyle önemli farklılıkları gösterir (t testi, p< 0,05).n>19. Ölçek çubuğu = 1 cm.(b) Uzama bölgesindeki epidermal hücrelerdeki kortikal mikrotübüller.25 uM KAND 11 içeren veya içermeyen MS plakaları üzerinde büyütülen vahşi tip Arabidopsis Col köklerindeki mikrotübüller, β-tubulin primer antikorları ve Alexa Fluor-konjuge sekonder antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal boyama ile görselleştirildi.Ölçek çubuğu = 10 µm.(c) Kök meristemindeki mikrotübüllerin mitotik yapısı.Mikrotübüller immünohistokimyasal boyama kullanılarak görüntülendi.Konfokal görüntülerden profaz bölgeleri, iğler ve fragmoplastlar dahil olmak üzere mitotik yapılar sayıldı.Oklar mitotik mikrotübül yapılarını gösterir.Yıldız işaretleri sahte tedaviyle önemli farklılıkları gösterir (t testi, p< 0,05).n>9. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Ursa'nın mikrotübül fonksiyonunu bozma yeteneği olmasına rağmen etki mekanizmasının tipik mikrotübül depolimerizasyon ajanlarından farklı olması bekleniyor.Örneğin, disopiramid ve orizalin gibi mikrotübül depolimerizasyon ajanlarının daha yüksek konsantrasyonları, epidermal hücrelerin anizotropik genişlemesini indüklerken KAND 11 bunu yapmaz.Ek olarak, KAND 11 ve disopiramidin birlikte uygulanması, birleşik disopiramid kaynaklı kök büyüme tepkisi ile sonuçlandı ve KAND 11 kaynaklı büyüme inhibisyonu gözlendi (Şekil S4).Ayrıca aşırı duyarlı disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11'e tepkisini de analiz ettik. phs1-1, kanonik olmayan bir tübülin kinaz noktası mutasyonuna sahiptir ve disopiramid ile tedavi edildiğinde daha kısa kökler üretir9,20.KAND 11 içeren agar ortamında yetiştirilen phs1-1 mutant fideleri, disopiramid üzerinde yetiştirilenlere benzer şekilde daha kısa köklere sahipti (Şekil S5).
Ek olarak, KAND 11 ile tedavi edilen fidelerin kök meristeminde profaz bölgeleri, iğler ve fragmoplastlar gibi mitotik mikrotübül yapıları gözlemledik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS gözlemleriyle tutarlı olarak, mitotik mikrotübüllerin sayısı gözlendi (Şekil 6c).
KAND 11'in sitotoksisitesini hücre altı çözünürlükte karakterize etmek için tütün BY-2 süspansiyon hücrelerini KAND 11 ile tedavi ettik ve tepkilerini gözlemledik.KAND 11'in kortikal mikrotübüller üzerindeki etkisini değerlendirmek için ilk olarak mikrotübülleri floresan olarak etiketleyen TagRFP-TUA6'yı eksprese eden BY-2 hücrelerine KAND 11'i ekledik.Kortikal mikrotübül yoğunluğu, sitoplazmik pikseller arasındaki hücre iskeleti piksellerinin yüzdesini ölçen görüntü analizi kullanılarak değerlendirildi.Test sonuçları, 1 saat boyunca 50 μM veya 100 μM KAND 11 ile tedaviden sonra yoğunluğun sırasıyla %0,94 ± 0,74 veya 0,23 ± %0,28'e önemli ölçüde düştüğünü, DMSO ile tedavi edilen hücrelerin yoğunluğunun ise 1,61 ± 0,34 olduğunu gösterdi. % (Şekil 7a).Bu sonuçlar Arabidopsis'te KAND 11 tedavisinin kortikal mikrotübüllerin depolimerizasyonunu indüklediği gözlemiyle tutarlıdır (Şekil 6b).Aynı konsantrasyonda KAND 11 ile işleme tabi tutulduktan sonra GFP-ABD etiketli aktin filamentlerine sahip BY-2 hattını da inceledik ve KAND 11 işleminin aktin filamentlerini bozduğunu gözlemledik.50 μM veya 100 μM KAND 11 ile 1 saat süreyle tedavi, aktin filaman yoğunluğunu sırasıyla %1,20 ± 0,62 veya %0,61 ± %0,26'ya önemli ölçüde azaltırken, DMSO ile tedavi edilen hücrelerdeki yoğunluk %1,69 ± 0,51 idi (Şekil 2).7b).Bu sonuçlar, aktin filamentlerini etkilemeyen propizamidin ve mikrotübülleri etkilemeyen bir aktin depolimerizatörü olan latrunculin B'nin etkileriyle çelişmektedir (SI Şekil S6).Ek olarak kumaronamid 1, kumaronamid asit 6 veya KAND 11 ile tedavi, HeLa hücrelerindeki mikrotübülleri etkilemedi (SI Şekil S7).Bu nedenle KAND 11'in etki mekanizmasının bilinen hücre iskeleti bozuculardan farklı olduğuna inanılmaktadır.Ek olarak, KAND 11 ile tedavi edilen BY-2 hücrelerine ilişkin mikroskobik gözlemimiz, KAND 11 tedavisi sırasında hücre ölümünün başladığını ortaya çıkardı ve Evans mavisi ile boyanmış ölü hücrelerin oranının, KAND 11 tedavisinden 30 dakika sonra önemli ölçüde artmadığını gösterdi. 50 μM veya 100 μM KAND ile 90 dakikalık tedaviden sonra ölü hücrelerin sayısı sırasıyla %43,7 veya %80,1'e yükseldi (Şekil 7c).Birlikte ele alındığında bu veriler, yeni ursolik asit türevi KAND 11'in, daha önce bilinmeyen bir etki mekanizmasına sahip, bitkiye özgü bir hücre iskeleti inhibitörü olduğunu göstermektedir.
KAND, kortikal mikrotübülleri, aktin filamentlerini ve tütün BY-2 hücrelerinin canlılığını etkiler.(a) BY-2 hücrelerinde kortikal mikrotübüllerin TagRFP-TUA6 varlığında görselleştirilmesi.KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile işleme tabi tutulan BY-2 hücreleri, konfokal mikroskopi ile incelendi.Kortikal mikrotübül yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı.Harfler önemli farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05).Ölçek çubuğu = 10 µm.(b) GFP-ABD2'nin varlığında görselleştirilen BY-2 hücrelerindeki kortikal aktin filamentleri.KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile işleme tabi tutulan BY-2 hücreleri, konfokal mikroskopi ile incelendi.Kortikal aktin filamentlerinin yoğunluğu, 25 bağımsız hücrenin mikrograflarından hesaplandı.Harfler önemli farklılıkları göstermektedir (Tukey HSD testi, p< 0,05).Ölçek çubuğu = 10 µm.(c) Ölü BY-2 hücrelerinin Evans mavisi boyama ile gözlemlenmesi.KAND 11 (50 μM veya 100 μM) veya DMSO ile işleme tabi tutulan BY-2 hücreleri, parlak alan mikroskobu ile incelendi.n=3.Ölçek çubuğu = 100 µm.
Yeni doğal ürünlerin keşfi ve uygulanması, tıp ve tarım da dahil olmak üzere insan yaşamının çeşitli yönlerinde önemli ilerlemelere yol açmıştır.Doğal kaynaklardan faydalı bileşikler elde etmek için tarihsel araştırmalar yapılmıştır.Özellikle aktinomisetlerin, tıbbi olarak antikanser ajanı olarak kullanılan avermektin, ivermektin ve bleomisin ve türevlerinin öncü bileşiği gibi çeşitli sekonder metabolitler üretme yeteneklerinden dolayı nematodlar için antiparazitik antibiyotikler olarak yararlı olduğu bilinmektedir21,22.Benzer şekilde, aktinomisetlerden çeşitli herbisidal bileşikler keşfedilmiştir ve bunlardan bazıları halihazırda ticari olarak kullanılmaktadır1,23.Bu nedenle, istenen biyolojik aktivitelere sahip doğal ürünleri izole etmek için aktinomiset metabolitlerinin analizinin etkili bir strateji olduğu düşünülmektedir.Bu çalışmada S. werraensis'ten yeni bir bileşik olan kumaronamidi keşfettik ve başarıyla sentezledik.Ursonik asit, urbenamid ve türevlerinin sentetik bir ara maddesidir.Karakteristik kök kıvrılmasına neden olabilir, orta ila güçlü ot öldürücü aktivite sergileyebilir ve doğrudan veya dolaylı olarak bitki mikrotübüllerine zarar verebilir.Bununla birlikte, KAND 11 aynı zamanda aktin filamentlerini bozduğundan ve hücre ölümüne neden olduğundan, ürmotonik asidin etki mekanizması mevcut mikrotübül inhibitörlerinden farklı olabilir; bu, ürmotonik asit ve türevlerinin çok çeşitli hücre iskeleti yapılarını etkilediği düzenleyici bir mekanizmayı akla getirir..
Urbenonik asidin daha ayrıntılı karakterizasyonu, urbenonik asidin etki mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.Özellikle bir sonraki amaç, ursonik asit ve türevlerinin doğrudan mikrotübüller üzerinde etki edip etmediğini ve onları depolimerize edip etmediğini veya bunların etkisinin mikrotübül dengesizleşmesiyle sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için ursonik asidin indirgenmiş mikrotübüllere bağlanma yeteneğini değerlendirmektir.Ek olarak, mikrotübüllerin doğrudan hedef olmadığı durumlarda, ursonik asidin bitki hücreleri üzerindeki etki yerinin ve moleküler hedeflerinin belirlenmesi, ilgili bileşiklerin özelliklerinin ve herbisidal aktiviteyi iyileştirmenin olası yollarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.Biyoaktivite analizimiz, ursonik asidin Arabidopsis thaliana, tütün ve karaciğer otu gibi bitkilerin büyümesi üzerindeki benzersiz sitotoksik yeteneğini ortaya çıkarırken, ne E. coli ne de HeLa hücreleri etkilenmedi.Açık tarım alanlarında kullanılmak üzere herbisitler olarak geliştirilmeleri halinde, ursonik asit türevlerinin hayvan hücrelerine çok az veya hiç toksisite oluşturmaması bir avantajdır.Aslında mikrotübüller ökaryotlarda yaygın yapılar olduğundan, bunların bitkilerde seçici olarak engellenmesi herbisitler için temel bir gerekliliktir.Örneğin, doğrudan tübüline bağlanan ve polimerizasyonu engelleyen bir mikrotübül depolimerizasyon maddesi olan propizamid, hayvan hücrelerine karşı düşük toksisitesi nedeniyle herbisit olarak kullanılır24.Disopiramidin aksine, ilgili benzamidlerin farklı hedef spesifiklikleri vardır.Bitki mikrotübüllerine ek olarak, RH-4032 veya benzoksamid de sırasıyla hayvan hücrelerinin veya oomisetlerin mikrotübüllerini inhibe eder ve zalilamit, düşük fitotoksisitesi nedeniyle fungisit olarak kullanılır25,26,27.Yeni keşfedilen ayı ve türevleri bitkilere karşı seçici sitotoksisite sergiliyor, ancak daha fazla modifikasyonun hedef özgüllüğünü değiştirebileceğini ve potansiyel olarak patojenik mantarların veya oomisetlerin kontrolü için ek türevler sağlayabileceğini belirtmekte fayda var.
Urbenonik asit ve türevlerinin benzersiz özellikleri, bunların herbisit olarak geliştirilmesinde ve araştırma aracı olarak kullanılmasında faydalıdır.Bitki hücresi şeklinin kontrol edilmesinde hücre iskeletinin önemi yaygın olarak bilinmektedir.Daha önceki çalışmalar, bitkilerin, morfogenezi uygun şekilde kontrol etmek için mikrotübül dinamiklerini kontrol ederek karmaşık kortikal mikrotübül organizasyonu mekanizmaları geliştirdiklerini göstermiştir.Mikrotübül aktivitesinin düzenlenmesinden sorumlu çok sayıda molekül tanımlanmış olup ilgili araştırmalar halen devam etmektedir3,4,28.Bitki hücrelerindeki mikrotübül dinamikleri hakkındaki mevcut anlayışımız, kortikal mikrotübül organizasyonunun mekanizmalarını tam olarak açıklamamaktadır.Örneğin, hem disopiramid hem de orizalin mikrotübülleri depolimerize edebilse de, disopiramid ciddi kök bozulmasına neden olurken orizalin nispeten hafif bir etkiye sahiptir.Dahası, mikrotübülleri stabilize eden tubulindeki mutasyonlar da köklerde dekstrorotasyona neden olurken, mikrotübül dinamiklerini de stabilize eden paklitaksel bunu yapmaz.Bu nedenle, ursolik asidin moleküler hedeflerinin incelenmesi ve tanımlanması, bitki kortikal mikrotübüllerinin düzenlenmesine ilişkin yeni bilgiler sağlamalıdır.Benzer şekilde, disopiramid gibi çarpık büyümeyi teşvik etmede etkili olan kimyasallar ile orizalin veya kumamotorik asit gibi daha az etkili kimyasalların gelecekteki karşılaştırmaları, çarpık büyümenin nasıl gerçekleştiğine dair ipuçları sağlayacaktır.
Öte yandan savunmayla ilişkili hücre iskeletindeki yeniden düzenlemeler, ursonik asidin sitotoksisitesini açıklayan başka bir olasılıktır.Bir patojenin enfeksiyonu veya bir elisitörün bitki hücrelerine sokulması bazen hücre iskeletinin tahrip olmasına ve ardından hücre ölümüne neden olur29.Örneğin, oomiset türevi kriptoksantin'in, KAND tedavisinde30,31 meydana gelene benzer şekilde, tütün hücresi ölümünden önce mikrotübülleri ve aktin filamentlerini bozduğu rapor edilmiştir.Savunma tepkileri ile ursonik asit tarafından tetiklenen hücresel tepkiler arasındaki benzerlikler, bunların ortak hücresel süreçleri tetiklediği hipotezini öne sürmemize yol açtı; ancak ursonik asidin kriptoksantin'den daha hızlı ve daha güçlü bir etkisi olduğu ortadadır.Ancak çalışmalar, aktin filamanlarının bozulmasının, her zaman mikrotübül bozulmasının eşlik etmediği kendiliğinden hücre ölümünü desteklediğini göstermiştir29.Buna ek olarak, ursonik asit türevlerinin yaptığı gibi, patojenin mi yoksa elisitörün çarpık kök büyümesine mi yol açtığı henüz belli değil.Bu nedenle, savunma yanıtlarını ve hücre iskeletini birbirine bağlayan moleküler bilgi, ele alınması gereken ilgi çekici bir sorundur.Ursonik asitle ilgili düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin yanı sıra değişen potansiyellere sahip bir dizi türevin varlığından yararlanarak, bilinmeyen hücresel mekanizmaları hedefleme fırsatları sağlayabilirler.
Birlikte ele alındığında, mikrotübül dinamiklerini modüle eden yeni bileşiklerin keşfi ve uygulanması, bitki hücresi şeklinin belirlenmesinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmaları ele almak için güçlü yöntemler sağlayacaktır.Bu bağlamda, yakın zamanda geliştirilen, mikrotübülleri ve aktin filamentlerini etkileyerek hücre ölümüne neden olan ürmotonik asit bileşiği, mikrotübül kontrolü ile bu diğer mekanizmalar arasındaki bağlantıyı deşifre etme fırsatı sağlayabilir.Böylece urbenonik asit kullanılarak yapılan kimyasal ve biyolojik analizler, bitki hücre iskeletini kontrol eden moleküler düzenleyici mekanizmaları anlamamıza yardımcı olacaktır.
S. werraensis MK493-CF1'i %2 (w/v) galaktoz, %2 (w/v) Esans macunu, %1 (w/v) Bacto bileşiminden oluşan 110 mL tohum ortamı içeren 500 mL'lik şaşkın Erlenmeyer şişesine aşılayın .-soyaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), %0,5 (a/h) mısır ekstraktı (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonya), %0,2 (a/h) (NH4)2SO4 ve deiyonize su içinde %0,2 CaCO3.(Sterilizasyondan önce pH 7,4).Tohum kültürleri döner bir çalkalayıcıda (180 rpm) 27°C'de 2 gün süreyle inkübe edildi.Katı hal fermantasyonu yoluyla üretim ekimi.Tohum kültürü (7 mi), 15 g preslenmiş arpa (MUSO Co., Ltd., Japonya) ve 25 g deiyonize sudan (pH ayarlanmamış) oluşan 40 g üretim ortamı içeren 500 ml'lik bir K-1 şişesine aktarıldı. sterilizasyondan önce).).Fermantasyon 30°C'de karanlıkta 14 gün süreyle gerçekleştirildi.Fermantasyon malzemesinin özü, 40 ml/şişe EtOH ile çıkarıldı ve santrifüjlendi (1500 g, 4°C, 10 dakika).Kültür süpernatanı (60 mi), %10 MeOH/EtOAc karışımı ile özümlendi.Organik katman, bir ters faz kolonu (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) üzerinde gradyan elüsyonu ile (0-10 dakika: %90) HPLC'ye tabi tutulan bir tortu (59,5 mg) elde etmek üzere indirgenmiş basınç altında buharlaştırıldı. 10 mm × uzunluk 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 dakika: %90 H2O/CH3CN ila %70 H2O/CH3CN (gradyan), 35–45 dakika: %90 H2O/EtOH, 45–155 dakika: %90 H2O /EtOH ila %100 EtOH (gradyan (gradyan), 155-200 dakika: %100 EtOH), 1,5 ml/dakika akış hızında, kumaronamid (1, 36,0 mg), beyaz amorf bir toz halinde izole edildi.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4.08(s,3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 8 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesaplanan değer: 141.0659, ölçülen değer: 141.0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia tohumları (Col-0), araştırma kullanımı izniyle Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi'nden (ABRC) elde edildi.Col-0 tohumları laboratuvar koşullarımızda çoğaltıldı ve muhafaza edildi ve yabani tip Arabidopsis bitkileri olarak kullanıldı.Arabidopsis tohumları yüzey sterilizasyonuna tabi tutuldu ve %2 sakkaroz (Fujifilm Wako Pure Chemical), %0,05 (a/h) 2-(4-morfolino)etansülfonik asit (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü Murashige ve Skoog ortamında kültürlendi. ).) ve %1,5 agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C'de ve sabit ışıkta.Phs1-1 mutantının tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı.
SR-1 soyunun tohumları T. Hashimoto (Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) tarafından sağlandı ve yabani tip tütün bitkileri olarak kullanıldı.Tütün tohumlarının yüzeyi sterilize edildi ve çimlenmeyi desteklemek için üç gece boyunca steril suya batırıldı, ardından %2 sakaroz, %0,05 (a/h) MES ve %0,8 gellan sakızı (Fujifilm Wako Pure Chemical) içeren yarı güçlü bir çözeltiye yerleştirildi. Murashige.ve Skoog ortamı) pH 5,7 ile hazırlandı ve 23°C'de sabit ışık altında inkübe edildi.
Tak-1 suşu, T. Kohchi (Kyoto Üniversitesi) tarafından sağlandı ve karaciğer otu çalışması için standart deney birimi olarak kullanıldı.Gemma, sterilize edilmiş kültür bitkilerinden elde edildi ve daha sonra %1 sakaroz ve %0.3 jellan sakızı içeren Gamborg B5 ortamı (Fujifilm Wako Pure Chemical) üzerine kaplandı ve sürekli ışık altında 23°C'de inkübe edildi.
Tütün BY-2 hücreleri (Nicotiana tabacum L. ev. Parlak Sarı 2), S. Hasezawa (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlandı.BY-2 hücreleri, değiştirilmiş Linsmeier ve Skoog ortamında 95 kat seyreltildi ve haftalık olarak 2,4-diklorofenoksiasetik asit32 ile desteklendi.Hücre süspansiyonu, karanlıkta 27°C'de 130 rpm'de döner bir çalkalayıcıda karıştırıldı.Hücreleri 10 kat taze ortam hacmiyle yıkayın ve aynı ortamda yeniden süspanse edin.Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri altında mikrotübül işaretleyici TagRFP-TUA6'yı veya aktin filaman işaretleyicisi GFP-ABD2'yi stabil bir şekilde eksprese eden BY-2 transgenik hücre çizgileri, tarif edildiği gibi33,34,35 üretildi.Bu hücre çizgileri, orijinal BY-2 hücre çizgisi için kullanılanlara benzer prosedürler kullanılarak muhafaza edilebilir ve senkronize edilebilir.
HeLa hücreleri, %5 CO2 içeren 37°C'lik bir inkübatörde %10 fetal sığır serumu, 1,2 U/ml penisilin ve 1,2 ug/ml streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM) (Life Technologies) kültürlendi.
Bu yazıda açıklanan tüm deneyler Japon biyogüvenlik düzenlemelerine ve yönergelerine uygun olarak yapıldı.
Bileşikler, stok çözeltiler halinde dimetil sülfoksit (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) içinde çözüldü ve Arabidopsis ve tütün için MS ortamında veya karaciğer otu için Gamborg B5 ortamında seyreltildi.Kök büyümesini engelleme deneyi için plaka başına 10'dan fazla tohum, belirtilen bileşikleri veya DMSO'yu içeren agar ortamına ekildi.Tohumlar 7 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi.Fidelerin fotoğrafları çekildi ve köklerin uzunluğu ölçüldü.Arabidopsis çimlenme tahlili için, plaka başına 48 tohum, 200 uM bileşik veya DMSO içeren agar ortamına ekildi.Arabidopsis tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve çimlenmeden 7 gün sonra (dag) çimlenen fidelerin sayısı sayıldı.Tütün çimlendirme tahlili için, plaka başına 24 tohum, 200 uM KAND veya DMSO içeren agar ortamına ekildi.Tütün tohumları bir büyüme odasında büyütüldü ve 14 gün sonra çimlenen fidelerin sayısı sayıldı.Ciğer otu büyümesini engelleme tahlili için, her plakadan 9 embriyo, belirtilen KAND veya DMSO konsantrasyonlarını içeren agar ortamına kaplandı ve 14 gün boyunca bir büyüme odasında inkübe edildi.
Kök meristem organizasyonunu görselleştirmek için 5 mg/ml propidium iyodür (PI) ile boyanmış fideleri kullanın.PI sinyalleri, bir TCS SPE eş odaklı lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak floresans mikroskobu ile gözlemlendi.
Köklerin β-glukuronidaz (GUS) ile histokimyasal boyaması Malami ve Benfey36tarafından açıklanan protokole göre yapıldı.Fideler gece boyunca %90 asetonda sabitlendi, 1 saat boyunca GUS tamponu içindeki 0.5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-p-d-glukuronik asit ile boyandı ve hidratlı bir kloraldehit çözeltisine yerleştirildi.(8 g kloral hidrat, 2 ml su ve 1 ml gliserol) ve bir Axio Imager M1 mikroskobu (Carl Zeiss) kullanılarak diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile gözlemlendi.
Dikey olarak yerleştirilen plakalar üzerinde yetiştirilen 7 günlük fidanların kök açıları ölçülmüştür.Kökün açısını, 6. adımda açıklandığı gibi yerçekimi vektörünün yönünden ölçün.
Kortikal mikrotübüllerin düzeni, protokol 37'de küçük değişikliklerle açıklandığı gibi gözlendi.Anti-β-tubulin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ve Alexa Fluor 488-konjuge anti-fare IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723), 1:1000 ve 1:100 seyreltmelerde birincil ve ikincil antikorlar olarak kullanıldı. sırasıyla.Floresan görüntüleri bir TCS SPE eş odaklı lazer tarama mikroskobu (Leica Microsystems) kullanılarak elde edildi.Üreticinin talimatlarına göre Z yığını görüntüleri edinin ve maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun.
HeLa hücre proliferasyon deneyi, üreticinin talimatlarına göre Hücre Sayım Kiti 8 (Dojindo) kullanılarak yapıldı.
E. coli DH5a'nın büyümesi, 600 nm'de (OD600) bir spektrofotometre kullanılarak kültürdeki hücre yoğunluğunun ölçülmesiyle analiz edildi.
Transgenik BY-2 hücrelerinde hücre iskeleti organizasyonu, bir CSU-X1 konfokal tarama cihazı (Yokogawa) ve bir sCMOS kamera (Zyla, Andor Technology) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlendi.Hücre iskeleti yoğunluğu, açıklandığı gibi ImageJ yazılımı kullanılarak konfokal görüntülerdeki sitoplazmik pikseller arasındaki hücre iskeleti piksellerinin yüzdesini ölçen görüntü analizi ile değerlendirildi38,39.
BY-2 hücrelerinde hücre ölümünü tespit etmek için hücre süspansiyonunun bir kısmı, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,05 Evans mavisi ile inkübe edildi.Ölü hücrelerin seçici Evans mavisi boyanması, boyanın sağlam plazma zarı40 tarafından canlı hücrelerden çıkarılmasına bağlıdır.Lekeli hücreler bir parlak alan mikroskobu (BX53, Olympus) kullanılarak gözlendi.
HeLa hücreleri, 37°C'de ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %10 FBS takviyeli DMEM'de büyütüldü.Hücreler, 100 uM KAND 11, kumamonamik asit 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) veya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ile 6 saat boyunca 37°C'de işlendi.Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca MetOH ile ve ardından 5 dakika boyunca asetat ile sabitlendi.Sabit hücreler, 2 saat boyunca %0,5 BSA/PBS içerisinde seyreltilmiş p-tubulin birincil antikoru (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ile inkübe edildi, 3 kez TBST ile yıkandı ve ardından Alexa Fluor keçi antikoru ile inkübe edildi.488 1 saat.– %0,5 BSA/PBS içerisinde seyreltilmiş Fare IgG'si (Thermo Fisher Scientific: A11001) ve 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).TBST ile üç kez yıkandıktan sonra lekeli hücreler Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskopta gözlendi.Görüntüler, MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak soğutulmuş bir Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerayla çekildi.
Gönderim zamanı: Haziran-17-2024