Çam nematodu, çam ormanı ekosistemlerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olduğu bilinen karantina göçmen endoparazitidir. Bu çalışma, halojenli indollerin çam nematodlarına karşı nematoid aktivitesini ve etki mekanizmalarını incelemektedir. 5-iyodoindol ve avermektinin (pozitif kontrol) çam nematodlarına karşı nematoid aktiviteleri düşük konsantrasyonlarda (10 μg/mL) benzer ve yüksekti. 5-iyodoindol doğurganlığı, üreme aktivitesini, embriyonik ve larval ölüm oranını ve lokomotor davranışı azalttı. Ligandların omurgasızlara özgü glutamat kapılı klorür kanal reseptörleri ile moleküler etkileşimleri, 5-iyodoindolün, avermektin gibi, reseptörün aktif bölgesine sıkıca bağlandığı fikrini desteklemektedir. 5-iyodoindol ayrıca nematodlarda anormal organ çökmesi/büzülmesi ve artmış vakuolizasyon dahil olmak üzere çeşitli fenotipik deformasyonlara neden olmuştur. Bu sonuçlar, vakuollerin nematod metilasyonunun aracılık ettiği ölümde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Daha da önemlisi, 5-iyodoindol her iki bitki türü (lahana ve turp) için de toksik değildir. Dolayısıyla, bu çalışma, çevre koşullarında iyodoindol uygulamasının çam solgunluğu hasarını kontrol altına alabileceğini göstermektedir.
Çam nematodu (Bursaphelenchus xylophilus), çam ormanı ekosistemlerine ciddi ekolojik zararlar verdiği bilinen göçmen endoparazitik nematodlar olan çam nematodlarına (PWN) aittir1. Çam nematodunun neden olduğu çam solgunluk hastalığı (PWD), Asya ve Avrupa da dahil olmak üzere birçok kıtada ciddi bir sorun haline gelmektedir ve Kuzey Amerika'da nematod, getirilen çam türlerini yok etmektedir1,2. Çam ağaçlarının azalması büyük bir ekonomik sorundur ve küresel yayılma ihtimali endişe vericidir3. Aşağıdaki çam türleri nematodun en sık saldırdığı türlerdir: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ve Pinus radiata4. Çam nematodu, enfeksiyondan haftalar veya aylar sonra çam ağaçlarını öldürebilen ciddi bir hastalıktır. Ayrıca, çam nematod salgınları çeşitli ekosistemlerde yaygın olarak görüldüğünden, kalıcı enfeksiyon zincirleri oluşmuştur1.
Bursaphelenchus xylophilus, Aphelenchoidea üst familyasına ve klad 102.5'e ait karantina bitki paraziti bir nematottur. Nematod, mantarlarla beslenir ve çam ağaçlarının odun dokularında çoğalarak dört farklı larva evresine (L1, L2, L3, L4 ve bir yetişkin) dönüşür1,6. Besin kıtlığı koşullarında, çam nematodu, vektörünü (çam kabuğu böceği (Monochamus alternatus)) parazitleyen özel bir larva evresine (dauer) geçer ve sağlıklı çam ağaçlarına taşınır. Sağlıklı konakçılarda, nematodlar bitki dokularına hızla göç eder ve parankimal hücrelerle beslenir; bu da bir dizi aşırı duyarlılık reaksiyonuna, çam solgunluğuna ve enfeksiyondan sonraki bir yıl içinde ölüme yol açar1,7,8.
Çam nematodlarının biyolojik kontrolü, 20. yüzyıla dayanan karantina önlemleriyle uzun zamandır zorlu bir süreç olmuştur. Çam nematodlarını kontrol altına almaya yönelik mevcut stratejiler, esas olarak odun fümigasyonu ve ağaç gövdelerine nematosit yerleştirilmesi gibi kimyasal uygulamaları içermektedir. En yaygın kullanılan nematodlar, avermektin ailesine ait olan avermektin ve avermektin benzoattır. Bu pahalı kimyasallar birçok nematod türüne karşı oldukça etkilidir ve çevresel açıdan güvenli kabul edilirler9. Ancak, bu nematodların tekrar tekrar kullanılmasının, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ve avermektinlere karşı kademeli olarak direnç geliştiren Trichostrongylus colubriformis ve Ostertagia circumcincta nematodları gibi çeşitli böcek zararlılarında gösterildiği gibi, neredeyse kesinlikle dirençli çam nematodlarının ortaya çıkmasına yol açacak bir seçilim baskısı yaratması beklenmektedir10,11,12. Bu nedenle, direnç modellerinin düzenli olarak incelenmesi ve PVD'yi kontrol etmek için alternatif, uygun maliyetli ve çevre dostu önlemler bulmak amacıyla nematod öldürücülerin sürekli olarak taranması gerekmektedir. Son yıllarda, birçok yazar nematod kontrol ajanı olarak bitki özleri, uçucu yağlar ve uçucu maddelerin kullanımını önermiştir13,14,15,16.
Yakın zamanda, hücreler arası ve alemler arası bir sinyal molekülü olan indolün Caenorhabditis elegans'ta nematisidal aktivitesini gösterdik 17 . İndol, mikrobiyal ekolojide yaygın bir hücre içi sinyaldir ve mikrobiyal fizyolojiyi, spor oluşumunu, plazmit stabilitesini, ilaç direncini, biyofilm oluşumunu ve virülansı etkileyen çok sayıda işlevi kontrol eder 18, 19 . İndol ve türevlerinin diğer patojenik nematodlara karşı aktivitesi incelenmemiştir. Bu çalışmada, 34 indolün çam nematodlarına karşı nematisidal aktivitesini araştırdık ve mikroskopi, zaman aralıklı fotoğrafçılık ve moleküler yerleştirme deneyleri kullanarak en güçlü 5-iyodoindolün etki mekanizmasını açıkladık ve bir tohum çimlenme testi kullanarak bitkiler üzerindeki toksik etkilerini değerlendirdik.
Daha önce yüksek konsantrasyonlarda (>1,0 mM) indolün nematodlar üzerinde nematod öldürücü etkiye sahip olduğu bildirilmiştir17. B. xylophilus'un (karışık yaşam evreleri) 1 mM'de indol veya 33 farklı indol türevi ile muamele edilmesinin ardından, B. xylophilus'un ölüm oranı, kontrol ve muamele edilmiş gruplardaki canlı ve ölü nematodların sayılmasıyla ölçülmüştür. Beş indol önemli nematoid öldürücü aktivite göstermiştir; muamele edilmemiş kontrol grubunun 24 saat sonra hayatta kalma oranı %95 ± 7'dir. Test edilen 34 indolden 1 mM'de 5-iyodoindol ve 4-floroindol %100 ölüme neden olurken, 5,6-difloroindigo, metilindol-7-karboksilat ve 7-iyodoindol yaklaşık %50 ölüme neden olmuştur (Tablo 1).
5-iyodoindolün çam nematodunun vakuol oluşumu ve metabolizması üzerindeki etkisi. (A) Avermektin ve 5-iyodoindolün yetişkin erkek nematodlar üzerindeki etkisi, (B) L1 evresi nematod yumurtaları ve (C) B. xylophilus metabolizması, (i) 0. saatte vakuoller gözlenmedi, uygulama sonucunda (ii) vakuoller, (iii) birden fazla vakuol birikmesi, (iv) vakuollerin şişmesi, (v) vakuollerin kaynaşması ve (vi) dev vakuollerin oluşumu meydana geldi. Kırmızı oklar vakuollerin şişmesini, mavi oklar vakuollerin kaynaşmasını ve siyah oklar dev vakuolleri göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 μm.
Ek olarak, bu çalışma çam nematodlarında metan kaynaklı ölümün ardışık sürecini de tanımlamıştır (Şekil 4C). Metanojenik ölüm, belirgin sitoplazmik vakuollerin birikmesiyle ilişkili apoptotik olmayan bir hücre ölümü türüdür27. Çam nematodlarında gözlenen morfolojik kusurlar, metan kaynaklı ölüm mekanizmasıyla yakından ilişkili görünmektedir. Farklı zamanlarda yapılan mikroskobik incelemeler, 5-iyodoindole (0,1 mM) 20 saatlik maruziyetten sonra dev vakuollerin oluştuğunu göstermiştir. Mikroskobik vakuoller 8 saatlik tedaviden sonra gözlemlendi ve sayıları 12 saat sonra arttı. 14 saat sonra birkaç büyük vakuol gözlemlendi. 12-16 saatlik tedaviden sonra birkaç kaynaşmış vakuol açıkça görüldü ve bu, vakuol füzyonunun metan kaynaklı ölüm mekanizmasının temeli olduğunu göstermektedir. 20 saat sonra, solucan boyunca birkaç dev vakuol bulundu. Bu gözlemler, C. elegans'ta metuozisin ilk raporunu temsil etmektedir.
5-iyodoindol ile tedavi edilen solucanlarda, solucanın eğilmesi ve ortama vakuol salınımı ile kanıtlandığı gibi, vakuol agregasyonu ve yırtılması da gözlemlenmiştir (Şekil 5). Yumurtadan çıkma sırasında normalde L2 tarafından sağlam tutulan yumurta kabuğu zarında da vakuol bozulması gözlemlenmiştir (Ek Şekil S2). Bu gözlemler, vakuol oluşumu ve süpürasyon sürecinde sıvı birikimi ve ozmoregülatör bozukluğun yanı sıra geri dönüşümlü hücre hasarının (RCI) da rol oynadığını desteklemektedir (Şekil 5).
Gözlemlenen vakuol oluşumunda iyodun rolünü varsayarak, sodyum iyodür (NaI) ve potasyum iyodürün (KI) nematoid öldürücü aktivitesini araştırdık. Bununla birlikte, konsantrasyonlarda (0,1, 0,5 veya 1 mM), 1 mM KI hafif bir nematoid öldürücü etkiye sahip olmasına rağmen, nematod sağkalımını ne de vakuol oluşumunu etkilemediler (Ek Şekil S5). Diğer yandan, 5-iyodoindol gibi 7-iyodoindol (1 veya 2 mM), çoklu vakuoller ve yapısal deformasyonlar oluşturdu (Ek Şekil S6). İki iyodoindol çam nematodlarında benzer fenotipik özellikler gösterirken, NaI ve KI göstermedi. İlginç bir şekilde, indol test edilen konsantrasyonlarda B. xylophilus'ta vakuol oluşumunu oluşturmadı (veri gösterilmemiştir). Sonuç olarak, indol-iyot kompleksinin B. xylophilus'un vakuolizasyonu ve metabolizmasından sorumlu olduğu doğrulandı.
Nematisidal aktivite açısından test edilen indoller arasında, 5-iyodoindol -5,89 kcal/mol ile en yüksek kayma indeksine sahipti, bunu 7-iyodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-floroindol (-4,33) ve indol (-4,03) takip ediyordu ( Şekil 6 ). 5-iyodoindolün lösin 218'e olan güçlü omurga hidrojen bağı, bağlanmasını sabitlerken, diğer tüm indol türevleri yan zincir hidrojen bağları yoluyla serin 260'a bağlanır. Diğer modellenmiş iyodoindoller arasında, 2-iyodoindolün -5,248 kcal/mol'lük bir bağlanma değeri vardır; bu, lösin 218 ile olan ana hidrojen bağı nedeniyledir. Diğer bilinen bağlanmalar arasında 3-iyodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iyodoindol (-4,0 kcal/mol) ve 6-floroindol (-2,6 kcal/mol) bulunur (Ek Şekil S8). Çoğu halojenli indol ve indolün kendisi, 5-iyodoindol ve 2-iyodoindol hariç, serin 260 ile bir bağ oluşturur. Lösin 218 ile hidrojen bağının, ivermektin için gözlemlendiği gibi (Ek Şekil S7), etkili reseptör-ligand bağlanmasının göstergesi olması, 5-iyodoindol ve 2-iyodoindolün, ivermektin gibi, lösin 218 aracılığıyla GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlandığını doğrular (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). Bu bağlanmanın GluCL kompleksinin açık gözenek yapısını korumak için gerekli olduğunu ve 5-iyodoindol, 2-iyodoindol, avermektin ve ivermektinin GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlanarak iyon kanalını açık tuttuğunu ve sıvı alımına izin verdiğini ileri sürüyoruz.
İndol ve halojenli indolün GluCL'ye moleküler yerleşimi. (A) indol, (B) 4-floroindol, (C) 7-iyodoindol ve (D) 5-iyodoindol ligandlarının GluCL'nin aktif bölgesine bağlanma yönleri. Protein bir kurdele ile temsil edilirken, omurga hidrojen bağları sarı noktalı çizgilerle gösterilmiştir. (A′), (B′), (C′) ve (D′), ilgili ligandların çevredeki amino asit kalıntılarıyla etkileşimlerini gösterirken, yan zincir hidrojen bağları pembe noktalı oklarla gösterilmiştir.
Lahana ve turp tohumlarının çimlenmesinde 5-iyodoindolün toksik etkisini değerlendirmek için deneyler yürütülmüştür. 5-iyodoindol (0,05 veya 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/mL), ilk çimlenme ve bitkicik çıkışı üzerinde çok az veya hiç etkiye sahip değildi (Şekil 7). Ayrıca, işlem görmemiş kontrollerin ve 5-iyodoindol veya avermektin ile işlem görmüş tohumların çimlenme oranı arasında önemli bir fark bulunamamıştır. Ana kök uzaması ve oluşan yanal kök sayısı üzerindeki etki önemsizdi, ancak 1 mM (aktif konsantrasyonunun 10 katı) 5-iyodoindol, yanal köklerin gelişimini hafifçe geciktirdi. Bu sonuçlar, 5-iyodoindolün bitki hücreleri için toksik olmadığını ve çalışılan konsantrasyonlarda bitki gelişim süreçlerine müdahale etmediğini göstermektedir.
5-iyodoindolün tohum çimlenmesine etkisi. B. oleracea ve R. raphanistrum tohumlarının Murashige ve Skoog agar besiyerinde, avermektin veya 5-iyodoindol içeren veya içermeyen ortamda çimlenmesi, filizlenmesi ve yanal köklenmesi. Çimlenme, 22°C'de 3 günlük inkübasyondan sonra kaydedildi.
Bu çalışma, indollerin nematodları öldürdüğü birkaç vakayı bildirmektedir. Daha da önemlisi, bu, çam iğnelerinde iyodoindolün metilasyonu (küçük vakuollerin kademeli olarak birleşerek dev vakuollere dönüşmesiyle oluşan ve sonunda zar yırtılmasına ve ölüme yol açan bir süreç) tetiklediği ilk rapordur. İyodoindol, ticari nematod öldürücü avermektin ile benzer önemli nematod öldürücü özellikler göstermektedir.
İndollerin prokaryotlarda ve ökaryotlarda biyofilm inhibisyonu/oluşumu, bakteriyel sağkalım ve patojenite dahil olmak üzere birden fazla sinyal iletim fonksiyonu uyguladığı daha önce bildirilmiştir19,32,33,34. Son zamanlarda, halojenli indollerin, indol alkaloidlerinin ve yarı sentetik indol türevlerinin potansiyel terapötik etkileri yoğun araştırma ilgisi çekmiştir35,36,37. Örneğin, halojenli indollerin kalıcı Escherichia coli ve Staphylococcus aureus hücrelerini öldürdüğü gösterilmiştir37. Ayrıca, halojenli indollerin diğer türlere, cinslere ve alemlere karşı etkinliğini incelemek bilimsel açıdan ilgi çekicidir ve bu çalışma bu hedefe ulaşma yolunda atılmış bir adımdır.
Burada, C. elegans'ta 5-iyodoindol kaynaklı ölümcül etki için geri dönüşümlü hücre hasarı (RCI) ve metilasyona dayalı bir mekanizma öneriyoruz (Şekil 4C ve 5). Şişkinlik ve vakuolar dejenerasyon gibi ödemli değişiklikler, sitoplazmada dev vakuoller olarak ortaya çıkan RCI ve metilasyonun göstergeleridir48,49. RCI, ATP üretimini azaltarak, ATPaz pompasının bozulmasına neden olarak veya hücre zarlarını bozarak ve hızlı bir Na+, Ca2+ ve su akışına neden olarak enerji üretimini engeller50,51,52. Hayvan hücrelerinde, Ca2+ ve su akışı nedeniyle sitoplazmada sıvı birikmesi sonucu intrasitoplazmik vakuoller ortaya çıkar53. İlginçtir ki, eğer hasar geçici ise ve hücreler belli bir süre ATP üretmeye başlarsa, bu hücre hasarı mekanizması tersine çevrilebilir, ancak hasar devam ederse veya kötüleşirse hücreler ölür.54 Gözlemlerimiz, 5-iyodoindol ile tedavi edilen nematodların stres koşullarına maruz kaldıktan sonra normal biyosentezi geri kazanamadığını göstermektedir.
B. xylophilus'ta 5-iyodoindolün neden olduğu metilasyon fenotipi, iyotun varlığına ve moleküler dağılımına bağlı olabilir, çünkü 7-iyodoindol, B. xylophilus üzerinde 5-iyodoindole kıyasla daha az inhibitör etkiye sahipti (Tablo 1 ve Ek Şekil S6). Bu sonuçlar, indoldeki piridil azot kısmının para-pozisyondan meta-pozisyona taşınmasının U251 hücrelerinde vakuolizasyonu, büyüme inhibisyonunu ve sitotoksisiteyi ortadan kaldırdığını bildiren Maltese ve ark. (2014) tarafından yapılan çalışmalarla kısmen tutarlıdır ve bu da molekülün proteindeki belirli bir aktif bölgeyle etkileşiminin kritik olduğunu göstermektedir27,44,45. Bu çalışmada gözlemlenen indol veya halojenli indol ile GluCL reseptörleri arasındaki etkileşimler de bu düşünceyi desteklemektedir, zira 5- ve 2-iyodoindolün incelenen diğer indollerden daha güçlü bir şekilde GluCL reseptörlerine bağlandığı bulunmuştur (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). İndolün ikinci veya beşinci pozisyonundaki iyotun, GluCL reseptörünün lösin 218'ine omurga hidrojen bağları aracılığıyla bağlandığı, diğer halojenli indollerin ve indolün kendisinin ise serin 260 ile zayıf yan zincir hidrojen bağları oluşturduğu bulunmuştur (Şekil 6). Bu nedenle, halojenin lokalizasyonunun vakuolar dejenerasyonun indüklenmesinde önemli bir rol oynadığını, 5-iyodoindolün sıkı bağlanmasının ise iyon kanalını açık tutarak hızlı sıvı akışına ve vakuol yırtılmasına izin verdiğini düşünüyoruz. Bununla birlikte, 5-iyodoindolün ayrıntılı etki mekanizması henüz belirlenmemiştir.
5-iyodoindolün pratik uygulamasından önce, bitkiler üzerindeki toksik etkisinin analiz edilmesi gerekmektedir. Tohum çimlendirme deneylerimiz, incelenen konsantrasyonlarda 5-iyodoindolün tohum çimlenmesi veya sonraki gelişim süreçleri üzerinde olumsuz bir etkisinin olmadığını göstermiştir (Şekil 7). Bu nedenle, bu çalışma, çam nematodlarının çam ağaçlarına verdiği zararı kontrol etmek için ekolojik ortamda 5-iyodoindol kullanımına bir temel oluşturmaktadır.
Önceki raporlar, indol bazlı tedavinin antibiyotik direnci ve kanser ilerlemesi sorununu ele almak için potansiyel bir yaklaşım sunduğunu göstermiştir55. Ayrıca, indoller antibakteriyel, antikanser, antioksidan, antienflamatuar, antidiyabetik, antiviral, antiproliferatif ve antitüberküloz aktivitelere sahiptir ve ilaç geliştirme için umut verici bir temel oluşturabilir56,57. Bu çalışma, iyotun antiparaziter ve antihelmintik bir ajan olarak potansiyel kullanımını ilk kez önermektedir.
Avermektin otuz yıl önce keşfedilmiş ve 2015 yılında Nobel Ödülü kazanmıştır ve antihelmintik olarak kullanımı hala aktif olarak devam etmektedir. Ancak, nematod ve böcek zararlılarında avermektinlere karşı direncin hızla gelişmesi nedeniyle, çam ağaçlarında PWN enfeksiyonunu kontrol etmek için alternatif, düşük maliyetli ve çevre dostu bir stratejiye ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma ayrıca, 5-iyodoindolün çam nematodlarını öldürme mekanizmasını ve bitki hücreleri için düşük toksisiteye sahip olduğunu bildirmektedir; bu da gelecekteki ticari uygulamaları için iyi olasılıklar sunmaktadır.
Tüm deneyler Yeungnam Üniversitesi, Gyeongsan, Kore Etik Komitesi tarafından onaylandı ve yöntemler Yeungnam Üniversitesi Etik Komitesi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
Yumurta kuluçka deneyleri, yerleşik prosedürler kullanılarak gerçekleştirildi43. Çıkım oranlarını (HR) değerlendirmek için, 1 günlük yetişkin nematodlar (yaklaşık 100 dişi ve 100 erkek), mantar içeren Petri kaplarına aktarıldı ve 24 saat büyümeye bırakıldı. Daha sonra yumurtalar izole edildi ve steril damıtılmış su içinde süspansiyon halinde 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile muamele edildi. Bu süspansiyonlar (500 μl; yaklaşık 100 yumurta), 24 kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularına aktarıldı ve 22 °C'de inkübe edildi. L2 sayımları 24 saatlik inkübasyondan sonra yapıldı, ancak hücreler ince bir platin tel ile uyarıldığında hareket etmezse ölü kabul edildi. Bu deney, her biri altı tekrarlı iki aşamada gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirilerek sunuldu. HR yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır:
Larval ölüm oranı daha önce geliştirilen prosedürler kullanılarak değerlendirildi. Nematod yumurtaları toplandı ve embriyolar steril damıtılmış suda çatlatılarak senkronize edildi ve L2 evre larvaları üretildi. Senkronize larvalar (yaklaşık 500 nematod) 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile muamele edildi ve B. cinerea Petri kaplarında yetiştirildi. 22 °C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra nematodlar steril damıtılmış suda toplandı ve L2, L3 ve L4 evrelerinin varlığı açısından incelendi. L3 ve L4 evrelerinin varlığı larval dönüşümü gösterirken, L2 evresinin varlığı dönüşüm olmadığını gösterdi. Görüntüler iRiS™ Dijital Hücre Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edildi. Bu deney altı tekrarlı iki evrede gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirildi ve sunuldu.
5-iyodoindol ve avermektinin tohumlar üzerindeki toksisitesi Murashige ve Skoog agar plakalarında çimlenme testleri kullanılarak değerlendirildi. 62 B. oleracea ve R. raphanistrum tohumları önce bir gün boyunca steril damıtılmış suda bekletildi, 1 ml %100 etanol ile yıkandı, 1 ml %50 ticari çamaşır suyu (%3 sodyum hipoklorit) ile 15 dakika sterilize edildi ve beş kez 1 ml steril suyla yıkandı. Sterilize edilen tohumlar daha sonra 0,86 g/l (0,2X) Murashige ve Skoog besiyeri ve 5-iyodoindol veya avermektin içeren veya içermeyen %0,7 bakteriyolojik agar içeren çimlenme agar plakalarına preslendi. Plakalar daha sonra 22 °C'de inkübe edildi ve 3 günlük inkübasyondan sonra görüntüler alındı. Bu deney, her biri altı tekrardan oluşan iki aşamada gerçekleştirildi.
Gönderim zamanı: 26 Şubat 2025