Çam nematodu, çam ormanı ekosistemlerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olduğu bilinen, karantina altına alınmış göçmen bir endoparazittir. Bu çalışma, halojenli indollerin çam nematodlarına karşı nematisidal aktivitesini ve etki mekanizmasını incelemektedir. 5-iyodoindol ve avermektinin (pozitif kontrol) çam nematodlarına karşı nematisidal aktiviteleri benzerdi ve düşük konsantrasyonlarda (10 μg/mL) yüksekti. 5-iyodoindol, doğurganlığı, üreme aktivitesini, embriyonik ve larva ölümlerini ve lokomotor davranışı azalttı. Ligandların omurgasızlara özgü glutamat kapılı klorür kanal reseptörleriyle moleküler etkileşimleri, 5-iyodoindolün, avermektin gibi, reseptörün aktif bölgesine sıkıca bağlandığı fikrini desteklemektedir. 5-iyodoindol ayrıca nematodlarda anormal organ çökmesi/küçülmesi ve artmış vakuolizasyon dahil olmak üzere çeşitli fenotipik deformasyonlara neden oldu. Bu sonuçlar, vakuollerin nematodların metilasyon aracılı ölümünde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Önemli olarak, 5-iyodoindol her iki bitki türü (lahana ve turp) için de toksik değildi. Dolayısıyla, bu çalışma, çevresel koşullar altında iyodoindol uygulamasının çam solgunluğu hasarını kontrol edebileceğini göstermektedir.
Çam ağacı nematodu (Bursaphelenchus xylophilus), çam ormanı ekosistemlerine ciddi ekolojik zararlar verdiği bilinen göçmen endoparazitik nematodlar olan çam ağacı nematodları (PWN) grubuna aittir. Çam ağacı nematodu tarafından neden olunan çam solgunluğu hastalığı (PWD), Asya ve Avrupa dahil olmak üzere birçok kıtada ciddi bir sorun haline gelmekte ve Kuzey Amerika'da nematod, tanıtılan çam türlerini yok etmektedir. Çam ağacı gerilemesi büyük bir ekonomik sorundur ve küresel yayılma olasılığı endişe vericidir. Nematod tarafından en sık saldırıya uğrayan çam türleri şunlardır: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii ve Pinus radiata. Çam nematodu, enfeksiyondan sonraki haftalar veya aylar içinde çam ağaçlarını öldürebilen ciddi bir hastalıktır. Ayrıca, çam nematodu salgınları çeşitli ekosistemlerde yaygındır, bu nedenle kalıcı enfeksiyon zincirleri oluşmuştur¹.
Bursaphelenchus xylophilus, Aphelenchoidea üst familyasına ve 102.5 kladesine ait karantina altına alınmış bir bitki paraziti nematodudur. Nematod, mantarlarla beslenir ve çam ağaçlarının odun dokularında üreyerek dört farklı larva evresine (L1, L2, L3, L4) ve yetişkin bireye dönüşür1,6. Besin kıtlığı koşullarında, çam nematodu özel bir larva evresine (dauer) geçer ve bu evrede taşıyıcısı olan çam kabuk böceğini (Monochamus alternatus) parazitler ve sağlıklı çam ağaçlarına bulaşır. Sağlıklı konaklarda, nematodlar bitki dokularında hızla göç eder ve parankimatöz hücrelerle beslenir; bu da enfeksiyondan sonraki bir yıl içinde bir dizi aşırı duyarlılık reaksiyonuna, çamda solmaya ve ölüme yol açar1,7,8.
Çam nematodlarının biyolojik kontrolü uzun zamandır zorlu bir sorun olmuştur ve karantina önlemleri 20. yüzyıla kadar uzanmaktadır. Çam nematodlarının kontrolüne yönelik mevcut stratejiler öncelikle kimyasal uygulamaları, örneğin odun fümigasyonunu ve ağaç gövdelerine nematit implantasyonunu içermektedir. En yaygın kullanılan nematit ilaçları, avermektin ailesine ait olan avermektin ve avermektin benzoattır. Bu pahalı kimyasallar birçok nematod türüne karşı oldukça etkilidir ve çevre açısından güvenli kabul edilir⁹. Bununla birlikte, bu nematit ilaçlarının tekrarlanan kullanımının, dirençli çam nematodlarının ortaya çıkmasına neredeyse kesin olarak yol açacak bir seçilim baskısı yaratması beklenmektedir; bu durum, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ve Trichostrongylus colubriformis ve Ostertagia circumcincta gibi avermektinlere karşı kademeli olarak direnç geliştiren çeşitli böcek zararlıları için gösterilmiştir¹⁰,¹¹,¹². Bu nedenle, PVD'yi kontrol altına almak için alternatif, uygun maliyetli ve çevre dostu önlemler bulmak amacıyla direnç modellerinin düzenli olarak incelenmesi ve nematit ilaçlarının sürekli olarak taranması gerekmektedir. Son yıllarda, birçok yazar bitki özleri, uçucu yağlar ve uçucu bileşiklerin nematod kontrol ajanları olarak kullanılmasını önermiştir13,14,15,16.
Son zamanlarda, hücreler arası ve türler arası sinyal molekülü olan indolün Caenorhabditis elegans'ta nematosit aktivitesini gösterdik 17. İndol, mikrobiyal ekolojide yaygın bir hücre içi sinyal olup, mikrobiyal fizyolojiyi, spor oluşumunu, plazmit stabilitesini, ilaç direncini, biyofilm oluşumunu ve virülansı etkileyen çok sayıda işlevi kontrol eder 18, 19. İndol ve türevlerinin diğer patojenik nematodlara karşı aktivitesi incelenmemiştir. Bu çalışmada, 34 indolün çam nematodlarına karşı nematosit aktivitesini araştırdık ve mikroskopi, zaman atlamalı fotoğrafçılık ve moleküler kenetlenme deneyleri kullanarak en güçlü 5-iyodoindolün etki mekanizmasını aydınlattık ve tohum çimlenme deneyi kullanarak bitkiler üzerindeki toksik etkilerini değerlendirdik.
Daha önce yapılan çalışmalarda, yüksek konsantrasyonlarda (>1,0 mM) indolün nematodlar üzerinde nematit öldürücü etkiye sahip olduğu bildirilmiştir17. B. xylophilus'un (karışık yaşam evreleri) 1 mM konsantrasyonda indol veya 33 farklı indol türevi ile muamele edilmesinin ardından, kontrol ve muamele edilmiş gruplarda canlı ve ölü nematodlar sayılarak B. xylophilus'un ölüm oranı ölçülmüştür. Beş indol önemli nematit öldürücü aktivite göstermiştir; muamele edilmemiş kontrol grubunun hayatta kalma oranı 24 saat sonra %95 ± 7 olmuştur. Test edilen 34 indolden 5-iyodoindol ve 4-floroindol 1 mM konsantrasyonda %100 ölüm oranına neden olurken, 5,6-difloroindigo, metilindol-7-karboksilat ve 7-iyodoindol yaklaşık %50 ölüm oranına neden olmuştur (Tablo 1).
5-iyodoindolün çam ağacı nematodunun vakuol oluşumu ve metabolizması üzerindeki etkisi. (A) Avermektin ve 5-iyodoindolün yetişkin erkek nematodlar üzerindeki etkisi, (B) L1 evresi nematod yumurtaları ve (C) B. xylophilus metabolizması, (i) 0 saatte vakuoller gözlenmedi, tedavi sonucunda (ii) vakuoller, (iii) birden fazla vakuolün birikmesi, (iv) vakuollerin şişmesi, (v) vakuollerin kaynaşması ve (vi) dev vakuollerin oluşumu. Kırmızı oklar vakuollerin şişmesini, mavi oklar vakuollerin kaynaşmasını ve siyah oklar dev vakuolleri göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 μm.
Ek olarak, bu çalışma aynı zamanda çam nematodlarında metan kaynaklı ölümün ardışık sürecini de tanımlamıştır (Şekil 4C). Metanojenik ölüm, belirgin sitoplazmik vakuollerin birikimiyle ilişkili, apoptoz dışı bir hücre ölümü türüdür27. Çam nematodlarında gözlemlenen morfolojik kusurların, metan kaynaklı ölüm mekanizmasıyla yakından ilişkili olduğu görülmektedir. Farklı zamanlarda yapılan mikroskobik incelemeler, 5-iyodoindol (0,1 mM) maruziyetinden 20 saat sonra dev vakuollerin oluştuğunu göstermiştir. Mikroskobik vakuoller, 8 saatlik işlemden sonra gözlemlenmiş ve sayıları 12 saat sonra artmıştır. 14 saat sonra birkaç büyük vakuol gözlemlenmiştir. 12-16 saatlik işlemden sonra birkaç kaynaşmış vakuol açıkça görülebilmekte olup, bu da vakuol kaynaşmasının metanojenik ölüm mekanizmasının temeli olduğunu göstermektedir. 20 saat sonra, solucan boyunca birkaç dev vakuol bulunmuştur. Bu gözlemler, C. elegans'ta metüozisin ilk raporunu temsil etmektedir.
5-iyodoindol ile tedavi edilen solucanlarda, solucanın bükülmesi ve vakuollerin çevreye salınmasıyla kanıtlandığı üzere, vakuol agregasyonu ve yırtılması da gözlemlendi (Şekil 5). Vakuol bozulması, normalde kuluçka sırasında L2 tarafından sağlam bir şekilde korunan yumurta kabuğu zarında da gözlemlendi (Ek Şekil S2). Bu gözlemler, vakuol oluşumu ve iltihaplanma sürecinde sıvı birikimi ve ozmoregülasyon yetersizliğinin yanı sıra geri dönüşümlü hücre hasarının (RCI) da rol oynadığını desteklemektedir (Şekil 5).
İyotun gözlemlenen vakuol oluşumundaki rolünü varsayarak, sodyum iyodür (NaI) ve potasyum iyodürün (KI) nematod öldürücü aktivitesini araştırdık. Bununla birlikte, 0,1, 0,5 veya 1 mM konsantrasyonlarda, nematod hayatta kalmasını veya vakuol oluşumunu etkilemediler (Ek Şekil S5), ancak 1 mM KI hafif bir nematod öldürücü etkiye sahipti. Öte yandan, 7-iyodoindol (1 veya 2 mM), 5-iyodoindol gibi, çoklu vakuollere ve yapısal deformasyonlara neden oldu (Ek Şekil S6). İki iyodoindol, çam nematodlarında benzer fenotipik özellikler gösterirken, NaI ve KI göstermedi. İlginç bir şekilde, indol, test edilen konsantrasyonlarda B. xylophilus'ta vakuol oluşumuna neden olmadı (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, elde edilen sonuçlar, indol-iyot kompleksinin B. xylophilus'un vakuolizasyonundan ve metabolizmasından sorumlu olduğunu doğrulamıştır.
Nematisidal aktivite açısından test edilen indoller arasında, 5-iyodoindol -5,89 kcal/mol ile en yüksek kayma indeksine sahipti, bunu sırasıyla 7-iyodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-floroindol (-4,33) ve indol (-4,03) izledi (Şekil 6). 5-iyodoindolün lösin 218'e olan güçlü omurga hidrojen bağı, bağlanmasını stabilize ederken, diğer tüm indol türevleri yan zincir hidrojen bağları yoluyla serin 260'a bağlanır. Modellenen diğer iyodoindoller arasında, 2-iyodoindolün bağlanma değeri -5,248 kcal/mol'dür ve bu, lösin 218 ile olan ana hidrojen bağı nedeniyle oluşmaktadır. Bilinen diğer bağlanmalar arasında 3-iyodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iyodoindol (-4,0 kcal/mol) ve 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) yer almaktadır (Ek Şekil S8). 5-iyodoindol ve 2-iyodoindol hariç, halojenli indollerin çoğu ve indolün kendisi serin 260 ile bağ oluşturur. İvermektin için gözlemlendiği gibi (Ek Şekil S7), lösin 218 ile hidrojen bağının reseptör-ligand bağlanmasının etkinliğinin göstergesi olması, 5-iyodoindol ve 2-iyodoindolün, ivermektin gibi, lösin 218 aracılığıyla GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlandığını doğrular (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). Bu bağlanmanın GluCL kompleksinin açık gözenek yapısını korumak için gerekli olduğunu ve 5-iyodoindol, 2-iyodoindol, avermektin ve ivermektinin GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlanarak iyon kanalını açık tuttuğunu ve sıvı alımına izin verdiğini öne sürüyoruz.
İndol ve halojenli indolün GluCL'ye moleküler kenetlenmesi. (A) indol, (B) 4-floroindol, (C) 7-iyodoindol ve (D) 5-iyodoindol ligandlarının GluCL'nin aktif bölgesine bağlanma yönelimleri. Protein bir şerit ile temsil edilir ve omurga hidrojen bağları sarı noktalı çizgilerle gösterilir. (A′), (B′), (C′) ve (D′), ilgili ligandların çevreleyen amino asit kalıntılarıyla etkileşimlerini gösterir ve yan zincir hidrojen bağları pembe noktalı oklarla belirtilmiştir.
Lahana ve turp tohumlarının çimlenmesi üzerindeki 5-iyodoindolün toksik etkisini değerlendirmek için deneyler yapılmıştır. 5-iyodoindol (0,05 veya 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/mL), ilk çimlenme ve fide oluşumu üzerinde çok az veya hiç etki göstermemiştir (Şekil 7). Ayrıca, işlenmemiş kontrol grupları ile 5-iyodoindol veya avermektin ile işlenmiş tohumların çimlenme oranları arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Ana kök uzaması ve oluşan yan kök sayısı üzerindeki etkisi önemsizdir, ancak 1 mM (aktif konsantrasyonunun 10 katı) 5-iyodoindol, yan köklerin gelişimini hafifçe geciktirmiştir. Bu sonuçlar, 5-iyodoindolün bitki hücreleri için toksik olmadığını ve incelenen konsantrasyonlarda bitki gelişim süreçlerine müdahale etmediğini göstermektedir.
5-iyodoindolün tohum çimlenmesi üzerindeki etkisi. B. oleracea ve R. raphanistrum tohumlarının avermektin veya 5-iyodoindol içeren veya içermeyen Murashige ve Skoog agar ortamında çimlenmesi, filizlenmesi ve yan köklenmesi. Çimlenme, 22°C'de 3 gün inkübasyondan sonra kaydedildi.
Bu çalışma, indoller tarafından nematodların öldürülmesine dair çeşitli vakaları rapor etmektedir. Daha da önemlisi, bu, iyodoindolün çam iğnelerinde metilasyona (küçük vakuollerin birikmesi ve bunların yavaş yavaş dev vakuollere dönüşmesiyle oluşan, sonunda zar yırtılmasına ve ölüme yol açan bir süreç) neden olduğuna dair ilk rapordur ve iyodoindol, ticari nematit öldürücü avermektin ile benzer önemli nematit öldürücü özellikler sergilemektedir.
İndollerin daha önce prokaryotlarda ve ökaryotlarda biyofilm inhibisyonu/oluşumu, bakteriyel hayatta kalma ve patojenite dahil olmak üzere çoklu sinyal fonksiyonları gösterdiği bildirilmiştir19,32,33,34. Son zamanlarda, halojenli indollerin, indol alkaloidlerinin ve yarı sentetik indol türevlerinin potansiyel terapötik etkileri geniş bir araştırma ilgisi çekmiştir35,36,37. Örneğin, halojenli indollerin inatçı Escherichia coli ve Staphylococcus aureus hücrelerini öldürdüğü gösterilmiştir37. Buna ek olarak, halojenli indollerin diğer türler, cinsler ve alemler üzerindeki etkinliğini incelemek bilimsel açıdan önemlidir ve bu çalışma bu hedefe ulaşmaya yönelik bir adımdır.
Burada, C. elegans'ta 5-iyodoindol kaynaklı ölümcüllüğe ilişkin, geri dönüşümlü hücre hasarı (RCI) ve metilasyona dayalı bir mekanizma öneriyoruz (Şekil 4C ve 5). Şişkinlik ve vakuoler dejenerasyon gibi ödemli değişiklikler, sitoplazmada dev vakuoller olarak kendini gösteren RCI ve metilasyonun göstergeleridir48,49. RCI, ATP üretimini azaltarak, ATPaz pompasının arızalanmasına neden olarak veya hücre zarlarını bozarak ve Na+, Ca2+ ve suyun hızlı bir şekilde içeri akmasına neden olarak enerji üretimini engeller50,51,52. Hücre içi vakuoller, Ca2+ ve suyun içeri akması nedeniyle sitoplazmada sıvı birikmesi sonucu hayvan hücrelerinde ortaya çıkar53. İlginç bir şekilde, hücre hasarının bu mekanizması, hasar geçiciyse ve hücreler belirli bir süre ATP üretmeye başlarsa geri dönüşümlüdür; ancak hasar devam ederse veya kötüleşirse hücreler ölür.54 Gözlemlerimiz, 5-iyodoindol ile tedavi edilen nematodların stres koşullarına maruz kaldıktan sonra normal biyosentezi geri kazanamadığını göstermektedir.
B. xylophilus'ta 5-iyodoindol tarafından indüklenen metilasyon fenotipi, iyotun varlığı ve moleküler dağılımından kaynaklanıyor olabilir, çünkü 7-iyodoindol, B. xylophilus üzerinde 5-iyodoindolden daha az inhibitör etkiye sahipti (Tablo 1 ve Ek Şekil S6). Bu sonuçlar, Maltese ve ark. (2014) tarafından yapılan çalışmalarla kısmen tutarlıdır; bu çalışmada, indoldeki piridil azot grubunun para konumundan meta konumuna translokasyonunun, U251 hücrelerinde vakuolizasyonu, büyüme inhibisyonunu ve sitotoksisiteyi ortadan kaldırdığı ve molekülün proteindeki belirli bir aktif bölgeyle etkileşiminin kritik olduğu öne sürülmüştür27,44,45. Bu çalışmada gözlemlenen indol veya halojenli indoller ile GluCL reseptörleri arasındaki etkileşimler de bu görüşü desteklemektedir; zira 5- ve 2-iyodoindolün, incelenen diğer indollerden daha güçlü bir şekilde GluCL reseptörlerine bağlandığı bulunmuştur (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). İndolün ikinci veya beşinci pozisyonundaki iyotun, omurga hidrojen bağları yoluyla GluCL reseptörünün lösin 218'ine bağlandığı, diğer halojenli indoller ve indolün kendisinin ise serin 260 ile zayıf yan zincir hidrojen bağları oluşturduğu bulunmuştur (Şekil 6). Bu nedenle, halojenin lokalizasyonunun vakuol dejenerasyonunun indüklenmesinde önemli bir rol oynadığını, 5-iyodoindolün sıkı bağlanmasının ise iyon kanalını açık tutarak hızlı sıvı akışına ve vakuol yırtılmasına izin verdiğini tahmin ediyoruz. Bununla birlikte, 5-iyodoindolün ayrıntılı etki mekanizması henüz belirlenmemiştir.
5-iyodoindolün pratik uygulamasına geçmeden önce, bitkiler üzerindeki toksik etkisinin analiz edilmesi gerekmektedir. Tohum çimlenmesi deneylerimiz, incelenen konsantrasyonlarda 5-iyodoindolün tohum çimlenmesi veya sonraki gelişim süreçleri üzerinde olumsuz bir etkisinin olmadığını göstermiştir (Şekil 7). Bu nedenle, bu çalışma, çam ağaçlarına zarar veren çam nematodlarının kontrolü için ekolojik ortamda 5-iyodoindol kullanımına temel oluşturmaktadır.
Önceki raporlar, indol bazlı tedavinin antibiyotik direnci ve kanser ilerlemesi sorununu ele almak için potansiyel bir yaklaşım olduğunu göstermiştir55. Ek olarak, indoller antibakteriyel, antikanser, antioksidan, antiinflamatuar, antidiyabetik, antiviral, antiproliferatif ve antitüberküloz aktivitelere sahiptir ve ilaç geliştirme için umut vadeden bir temel oluşturabilir56,57. Bu çalışma, iyotun antiparazitik ve antelmintik bir ajan olarak potansiyel kullanımını ilk kez önermektedir.
Avermektin otuz yıl önce keşfedildi ve 2015 yılında Nobel Ödülü'nü kazandı; antelmintik olarak kullanımı halen aktif olarak devam etmektedir. Bununla birlikte, nematodlarda ve böcek zararlılarında avermektinlere karşı direncin hızla gelişmesi nedeniyle, çam ağaçlarındaki PWN enfeksiyonunu kontrol etmek için alternatif, düşük maliyetli ve çevre dostu bir stratejiye ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma ayrıca, 5-iyodoindolün çam nematodlarını öldürme mekanizmasını ve 5-iyodoindolün bitki hücrelerine düşük toksisiteye sahip olduğunu ortaya koyarak, gelecekteki ticari uygulamaları için iyi перспектиfler sunmaktadır.
Tüm deneyler Kore, Gyeongsan'daki Yeungnam Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır ve yöntemler Yeungnam Üniversitesi Etik Kurulu'nun yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Yumurta kuluçka deneyleri, yerleşik prosedürler kullanılarak gerçekleştirildi43. Kuluçka oranlarını (HR) değerlendirmek için, 1 günlük yetişkin nematodlar (yaklaşık 100 dişi ve 100 erkek) mantar içeren Petri kaplarına aktarıldı ve 24 saat boyunca büyümelerine izin verildi. Daha sonra yumurtalar izole edildi ve steril damıtılmış suda süspansiyon halinde 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile muamele edildi. Bu süspansiyonlar (500 μl; yaklaşık 100 yumurta) 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına aktarıldı ve 22 °C'de inkübe edildi. L2 sayımları 24 saatlik inkübasyondan sonra yapıldı, ancak hücreler ince bir platin tel ile uyarıldığında hareket etmezlerse ölü kabul edildi. Bu deney, her biri altı tekrardan oluşan iki aşamada gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirildi ve sunuldu. HR yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır:
Larva ölüm oranı, daha önce geliştirilen prosedürler kullanılarak değerlendirildi. Nematod yumurtaları toplandı ve embriyolar, steril damıtılmış suda kuluçkaya yatırılarak L2 evresi larvaları oluşturmak üzere senkronize edildi. Senkronize edilmiş larvalar (yaklaşık 500 nematod), 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile muamele edildi ve B. cinerea Petri kaplarında yetiştirildi. 22 °C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra, nematodlar steril damıtılmış suda toplandı ve L2, L3 ve L4 evrelerinin varlığı açısından incelendi. L3 ve L4 evrelerinin varlığı larva dönüşümünü gösterirken, L2 evresinin varlığı dönüşümün olmadığını gösterdi. Görüntüler, iRiS™ Dijital Hücre Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edildi. Bu deney, her biri altı tekrardan oluşan iki aşamada gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirilerek sunuldu.
5-iyodoindol ve avermektinin tohumlara olan toksisitesi, Murashige ve Skoog agar plakalarında çimlenme testleri kullanılarak değerlendirildi.62 B. oleracea ve R. raphanistrum tohumları önce bir gün boyunca steril damıtılmış suda bekletildi, 1 ml %100 etanol ile yıkandı, 1 ml %50 ticari çamaşır suyu (%3 sodyum hipoklorit) ile 15 dakika süreyle sterilize edildi ve 1 ml steril su ile beş kez yıkandı. Sterilize edilmiş tohumlar daha sonra 0,86 g/l (0,2X) Murashige ve Skoog ortamı ve %0,7 bakteriyolojik agar içeren, 5-iyodoindol veya avermektinli veya avermektinsiz çimlenme agar plakalarına bastırıldı. Plakalar daha sonra 22 °C'de inkübe edildi ve 3 günlük inkübasyondan sonra görüntüler alındı. Bu deney, her biri altı tekrardan oluşan iki aşamada gerçekleştirildi.
Yayın tarihi: 26 Şubat 2025