Çam nematodu, çam ormanı ekosistemlerinde ciddi ekonomik kayıplara neden olduğu bilinen karantina göçmen endoparazitidir. Mevcut çalışma, halojenli indollerin çam nematodlarına karşı nematoid aktivitesini ve etki mekanizmalarını gözden geçirmektedir. 5-iyodoindol ve avermektinin (pozitif kontrol) çam nematodlarına karşı nematoid aktiviteleri düşük konsantrasyonlarda (10 μg/mL) benzer ve yüksekti. 5-iyodoindol doğurganlığı, üreme aktivitesini, embriyonik ve larval ölüm oranını ve lokomotor davranışı azalttı. Ligandların omurgasızlara özgü glutamat kapılı klorür kanal reseptörleriyle moleküler etkileşimleri, 5-iyodoindolün avermektin gibi reseptörün aktif bölgesine sıkıca bağlandığı fikrini desteklemektedir. 5-iyodoindol ayrıca nematodlarda anormal organ çöküşü/büzülmesi ve artan vakuolizasyon dahil olmak üzere çeşitli fenotipik deformasyonlara neden oldu. Bu sonuçlar vakuollerin nematod metilasyon aracılı ölümde rol oynayabileceğini göstermektedir. Önemlisi, 5-iyodoindol her iki bitki türü (lahana ve turp) için de toksik değildi. Bu nedenle, bu çalışma iyodoindol uygulamasının çevre koşulları altında çam solgunluğu hasarını kontrol edebileceğini göstermektedir.
Çam nematodu (Bursaphelenchus xylophilus), çam ormanı ekosistemlerine ciddi ekolojik zararlar verdiği bilinen göçmen endoparazitik nematodlar olan çam nematodu (PWN) grubuna aittir1. Çam nematodu tarafından meydana getirilen çam solgunluk hastalığı (PWD), Asya ve Avrupa da dahil olmak üzere birçok kıtada ciddi bir sorun haline gelmektedir ve Kuzey Amerika'da nematod, getirilen çam türlerini yok etmektedir1,2. Çam ağaçlarındaki düşüş büyük bir ekonomik sorundur ve küresel yayılma olasılığı endişe vericidir3. Aşağıdaki çam türleri nematodun en sık saldırdığı türlerdir: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ve Pinus radiata4. Çam nematodu, enfeksiyondan haftalar veya aylar sonra çam ağaçlarını öldürebilen ciddi bir hastalıktır. Ayrıca, çam nematod salgınları çeşitli ekosistemlerde yaygın olarak görüldüğünden, kalıcı enfeksiyon zincirleri oluşmuştur1.
Bursaphelenchus xylophilus, Aphelenchoidea üst familyasına ve klad 102.5'e ait karantina bitki paraziti bir nematoddur. Nematod mantarlarla beslenir ve çam ağaçlarının odun dokularında çoğalır ve dört farklı larva aşamasına dönüşür: L1, L2, L3, L4 ve bir yetişkin birey1,6. Gıda kıtlığı koşullarında, çam nematodu, vektörünü - çam kabuğu böceğini (Monochamus alternatus) parazite eden özel bir larva aşamasına - dauer'e geçer ve sağlıklı çam ağaçlarına aktarılır. Sağlıklı konaklarda, nematodlar bitki dokuları arasında hızla göç eder ve parankimal hücrelerle beslenir, bu da bir dizi aşırı duyarlılık reaksiyonuna, çam solmasına ve enfeksiyondan sonraki bir yıl içinde ölüme yol açar1,7,8.
Çam nematodlarının biyolojik kontrolü uzun zamandır bir zorluk olmuştur ve karantina önlemleri 20. yüzyıla kadar uzanmaktadır. Çam nematodlarını kontrol etmeye yönelik mevcut stratejiler, esas olarak odun fümigasyonu ve ağaç gövdelerine nematosit implantasyonu gibi kimyasal işlemleri içerir. En yaygın kullanılan nematositler, avermektin ailesine ait olan avermektin ve avermektin benzoattır. Bu pahalı kimyasallar birçok nematod türüne karşı oldukça etkilidir ve çevresel olarak güvenli kabul edilir9. Ancak, bu nematositlerin tekrar tekrar kullanılmasının, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ve avermektinlere karşı kademeli olarak direnç geliştiren nematodlar Trichostrongylus colubriformis ve Ostertagia circumcincta gibi birkaç böcek zararlısı için gösterildiği gibi, neredeyse kesinlikle dirençli çam nematodlarının ortaya çıkmasına yol açacak bir seçilim baskısı yaratması beklenmektedir10,11,12. Bu nedenle, direnç kalıplarının düzenli olarak incelenmesi ve PVD'yi kontrol etmek için alternatif, uygun maliyetli ve çevre dostu önlemler bulmak için nematositlerin sürekli olarak taranması gerekir. Son yıllarda, bir dizi yazar nematod kontrol ajanları olarak bitki özlerinin, uçucu yağların ve uçucu maddelerin kullanımını önermiştir13,14,15,16.
Yakın zamanda Caenorhabditis elegans'ta hücreler arası ve alemler arası bir sinyal molekülü olan indolün nematisidal aktivitesini gösterdik 17 . İndol, mikrobiyal ekolojide yaygın bir hücre içi sinyaldir ve mikrobiyal fizyolojiyi, spor oluşumunu, plazmit stabilitesini, ilaç direncini, biyofilm oluşumunu ve virülansı etkileyen çok sayıda işlevi kontrol eder 18, 19 . İndol ve türevlerinin diğer patojenik nematodlara karşı aktivitesi incelenmemiştir. Bu çalışmada, 34 indolün çam nematodlarına karşı nematisidal aktivitesini araştırdık ve mikroskopi, zaman aralıklı fotoğrafçılık ve moleküler yerleştirme deneyleri kullanarak en güçlü 5-iyodoindolün etki mekanizmasını açıkladık ve bir tohum çimlenme testi kullanarak bitkiler üzerindeki toksik etkilerini değerlendirdik.
Daha önce yüksek konsantrasyonlarda (>1,0 mM) indolün nematodlar üzerinde nematod öldürücü bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir17. B. xylophilus'un (karışık yaşam evreleri) 1 mM'de indol veya 33 farklı indol türevi ile muamele edilmesinin ardından, B. xylophilus'un ölüm oranı kontrol ve muamele edilen gruplarda canlı ve ölü nematodların sayılmasıyla ölçülmüştür. Beş indol önemli nematoid öldürücü aktivite göstermiştir; muamele edilmeyen kontrol grubunun hayatta kalma oranı 24 saat sonra %95 ± 7 olmuştur. Test edilen 34 indolden 1 mM'de 5-iyodoindol ve 4-floroindol %100 ölüm oranına neden olurken, 5,6-difloroindigo, metilindol-7-karboksilat ve 7-iyodoindol yaklaşık %50 ölüm oranına neden olmuştur (Tablo 1).
5-iyodoindolün çam odun nematodunun vakuol oluşumu ve metabolizması üzerine etkisi. (A) Avermektin ve 5-iyodoindolün yetişkin erkek nematodlar üzerindeki etkisi, (B) L1 evresi nematod yumurtaları ve (C) B. xylophilus'un metabolizması, (i) 0. saatte vakuoller gözlenmedi, işlem (ii) vakuoller, (iii) çoklu vakuollerin birikmesi, (iv) vakuollerin şişmesi, (v) vakuollerin kaynaşması ve (vi) dev vakuollerin oluşumu ile sonuçlandı. Kırmızı oklar vakuollerin şişmesini, mavi oklar vakuollerin kaynaşmasını ve siyah oklar dev vakuolleri göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 μm.
Ek olarak, bu çalışma çam nematodlarında metan kaynaklı ölümün ardışık sürecini de tanımlamıştır (Şekil 4C). Metanojenik ölüm, belirgin sitoplazmik vakuollerin birikmesiyle ilişkili apoptotik olmayan bir hücre ölümü türüdür27. Çam nematodlarında gözlenen morfolojik kusurlar, metan kaynaklı ölüm mekanizmasıyla yakından ilişkili görünmektedir. Farklı zamanlarda yapılan mikroskobik incelemeler, 5-iyodoindole (0,1 mM) 20 saatlik maruziyetten sonra dev vakuollerin oluştuğunu göstermiştir. Mikroskobik vakuoller 8 saatlik tedaviden sonra gözlemlendi ve sayıları 12 saat sonra arttı. 14 saat sonra birkaç büyük vakuol gözlemlendi. 12-16 saatlik tedaviden sonra birkaç kaynaşmış vakuol açıkça görüldü ve bu, vakuol füzyonunun metan kaynaklı ölüm mekanizmasının temeli olduğunu göstermektedir. 20 saat sonra, solucan boyunca birkaç dev vakuol bulundu. Bu gözlemler, C. elegans'ta metuosis'in ilk raporunu temsil etmektedir.
5-iyodoindol ile tedavi edilen solucanlarda, solucanın eğilmesi ve ortama vakuol salınmasıyla kanıtlandığı gibi, vakuol agregasyonu ve yırtılması da gözlemlendi (Şekil 5). Yumurta kabuğu zarında da vakuol bozulması gözlemlendi; bu zar, yumurtadan çıkma sırasında L2 tarafından normalde bozulmadan korunur (Ek Şekil S2). Bu gözlemler, vakuol oluşumu ve süpürasyon sürecinde sıvı birikimi ve ozmoregülatör başarısızlığın yanı sıra geri dönüşümlü hücre hasarının (RCI) da rol oynadığını destekler (Şekil 5).
Gözlemlenen vakuol oluşumunda iyodun rolünü varsayarak, sodyum iyodürün (NaI) ve potasyum iyodürün (KI) nematoid öldürücü aktivitesini araştırdık. Ancak, konsantrasyonlarda (0,1, 0,5 veya 1 mM), nematod sağkalımını ne de vakuol oluşumunu etkilemediler (Ek Şekil S5), ancak 1 mM KI hafif bir nematoid öldürücü etkiye sahipti. Öte yandan, 5-iyodoindol gibi 7-iyodoindol (1 veya 2 mM), çoklu vakuoller ve yapısal deformasyonlar oluşturdu (Ek Şekil S6). İki iyodoindol çam nematodlarında benzer fenotipik özellikler gösterirken, NaI ve KI göstermedi. İlginç bir şekilde, indol test edilen konsantrasyonlarda B. xylophilus'ta vakuol oluşumunu oluşturmadı (veri gösterilmemiştir). Bu sonuçlar, indol-iyot kompleksinin B. xylophilus'un vakuolizasyonu ve metabolizmasından sorumlu olduğunu doğruladı.
Nematisidal aktivite için test edilen indoller arasında, 5-iyodoindol -5,89 kcal/mol ile en yüksek kayma indeksine sahipti, bunu 7-iyodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-floroindol (-4,33) ve indol (-4,03) takip ediyordu ( Şekil 6 ). 5-iyodoindolün lösin 218'e olan güçlü omurga hidrojen bağı, bağlanmasını sabitlerken, diğer tüm indol türevleri yan zincir hidrojen bağları yoluyla serin 260'a bağlanır. Diğer modellenmiş iyodoindoller arasında, 2-iyodoindolün lösin 218 ile olan ana hidrojen bağı nedeniyle -5,248 kcal/mol'lük bir bağlanma değeri vardır. Diğer bilinen bağlanmalar arasında 3-iyodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iyodoindol (-4,0 kcal/mol) ve 6-floroindol (-2,6 kcal/mol) bulunur (Ek Şekil S8). Çoğu halojenli indol ve indolün kendisi, 5-iyodoindol ve 2-iyodoindol hariç, serin 260 ile bir bağ oluşturur. Lösin 218 ile hidrojen bağının, ivermektin için gözlemlendiği gibi (Ek Şekil S7), etkili reseptör-ligand bağlanmasının göstergesi olması, 5-iyodoindol ve 2-iyodoindolün, ivermektin gibi, lösin 218 aracılığıyla GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlandığını doğrular (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). Bu bağlanmanın GluCL kompleksinin açık gözenek yapısını korumak için gerekli olduğunu ve GluCL reseptörünün aktif bölgesine sıkıca bağlanarak 5-iyodoindol, 2-iyodoindol, avermektin ve ivermektinin iyon kanalını açık tuttuğunu ve sıvı alımına izin verdiğini ileri sürüyoruz.
İndol ve halojenli indolün GluCL'ye moleküler yerleşimi. (A) indol, (B) 4-floroindol, (C) 7-iyodoindol ve (D) 5-iyodoindol ligandlarının GluCL'nin aktif bölgesine bağlanma yönelimleri. Protein bir kurdele ile temsil edilir ve omurga hidrojen bağları sarı noktalı çizgilerle gösterilir. (A′), (B′), (C′) ve (D′) karşılık gelen ligandların çevredeki amino asit kalıntılarıyla etkileşimlerini gösterir ve yan zincir hidrojen bağları pembe noktalı oklarla gösterilir.
Lahana ve turp tohumlarının çimlenmesinde 5-iyodoindolün toksik etkisini değerlendirmek için deneyler yürütüldü. 5-iyodoindol (0,05 veya 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/mL), ilk çimlenme ve bitkicik çıkışı üzerinde çok az veya hiç etkiye sahip değildi (Şekil 7). Ayrıca, 5-iyodoindol veya avermektin ile muamele edilmiş tohumların ve muamele edilmemiş kontrollerin çimlenme oranları arasında önemli bir fark bulunmadı. Ana kök uzaması ve oluşan yanal kök sayısı üzerindeki etki önemsizdi, ancak 1 mM (aktif konsantrasyonunun 10 katı) 5-iyodoindol, yanal köklerin gelişimini hafifçe geciktirdi. Bu sonuçlar, 5-iyodoindolün bitki hücreleri için toksik olmadığını ve incelenen konsantrasyonlarda bitki gelişim süreçlerine müdahale etmediğini göstermektedir.
5-iyodoindolün tohum çimlenmesine etkisi. Murashige ve Skoog agar ortamında avermektin veya 5-iyodoindol ile veya bunlar olmadan B. oleracea ve R. raphanistrum tohumlarının çimlenmesi, filizlenmesi ve yanal köklenmesi. Çimlenme, 22°C'de 3 günlük inkübasyondan sonra kaydedildi.
Bu çalışma, indoller tarafından nematodların öldürüldüğü birkaç vakayı bildirmektedir. Önemlisi, bu, çam iğnelerinde iyodoindolün metilasyonu (küçük vakuollerin kademeli olarak dev vakuollere dönüşmesiyle oluşan ve sonunda membran yırtılmasına ve ölüme yol açan bir süreç) indüklediğine dair ilk rapordur ve iyodoindol, ticari nematoid avermektin ile benzer önemli nematoid öldürücü özellikler göstermektedir.
İndollerin daha önce prokaryotlarda ve ökaryotlarda biyofilm inhibisyonu/oluşumu, bakteriyel sağkalım ve patojenite dahil olmak üzere birden fazla sinyalleme işlevi uyguladığı bildirilmiştir19,32,33,34. Son zamanlarda, halojenli indollerin, indol alkaloidlerinin ve yarı sentetik indol türevlerinin potansiyel terapötik etkileri kapsamlı araştırma ilgisi çekmiştir35,36,37. Örneğin, halojenli indollerin kalıcı Escherichia coli ve Staphylococcus aureus hücrelerini öldürdüğü gösterilmiştir37. Ek olarak, halojenli indollerin diğer türlere, cinslere ve krallıklara karşı etkinliğini incelemek bilimsel açıdan ilgi çekicidir ve bu çalışma bu hedefe ulaşma yolunda atılmış bir adımdır.
Burada, C. elegans'ta 5-iyodoindol kaynaklı ölümcül etki için geri dönüşümlü hücre hasarı (RCI) ve metilasyona dayalı bir mekanizma öneriyoruz (Şekil 4C ve 5). Şişkinlik ve vakuolar dejenerasyon gibi ödemli değişiklikler RCI ve metilasyonun göstergeleridir ve sitoplazmada dev vakuoller olarak ortaya çıkar48,49. RCI, ATP üretimini azaltarak, ATPaz pompasının bozulmasına neden olarak veya hücre zarlarını bozarak ve Na+, Ca2+ ve suyun hızlı bir şekilde içeri girmesine neden olarak enerji üretimini engeller50,51,52. Hayvan hücrelerinde sitoplazmada Ca2+ ve suyun içeri girmesi nedeniyle sıvı birikmesi sonucu intrasitoplazmik vakuoller ortaya çıkar53. İlginçtir ki, eğer hasar geçici ise ve hücreler belli bir süre ATP üretmeye başlarsa, bu hücre hasarı mekanizması tersine çevrilebilir; fakat hasar devam ederse veya kötüleşirse, hücreler ölür.54 Gözlemlerimiz, 5-iyodoindol ile tedavi edilen nematodların stres koşullarına maruz kaldıktan sonra normal biyosentezi geri yükleyemediğini göstermektedir.
B. xylophilus'ta 5-iyodoindolün neden olduğu metilasyon fenotipi, iyodun varlığına ve moleküler dağılımına bağlı olabilir, çünkü 7-iyodoindolün B. xylophilus üzerinde 5-iyodoindolden daha az inhibitör etkisi vardı (Tablo 1 ve Ek Şekil S6). Bu sonuçlar, indoldeki piridil nitrojen kısmının para- konumundan meta- konumuna taşınmasının U251 hücrelerinde vakuolizasyonu, büyüme inhibisyonunu ve sitotoksisiteyi ortadan kaldırdığını bildiren Maltese ve ark. (2014) tarafından yapılan çalışmalarla kısmen tutarlıdır ve bu, molekülün proteindeki belirli bir aktif bölgeyle etkileşiminin kritik olduğunu göstermektedir27,44,45. Bu çalışmada gözlemlenen indol veya halojenli indoller ile GluCL reseptörleri arasındaki etkileşimler de bu fikri desteklemektedir, çünkü 5- ve 2-iyodoindolün incelenen diğer indollerden daha güçlü bir şekilde GluCL reseptörlerine bağlandığı bulunmuştur (Şekil 6 ve Ek Şekil S8). İndolün ikinci veya beşinci pozisyonundaki iyodun, omurga hidrojen bağları aracılığıyla GluCL reseptörünün lösin 218'ine bağlandığı, diğer halojenli indollerin ve indolün kendisinin ise serin 260 ile zayıf yan zincir hidrojen bağları oluşturduğu bulunmuştur (Şekil 6). Bu nedenle halojenin lokalizasyonunun vakuolar dejenerasyonun indüklenmesinde önemli bir rol oynadığını, 5-iyodoindolün sıkı bağlanmasının ise iyon kanalını açık tutarak hızlı sıvı akışına ve vakuol kopmasına izin verdiğini tahmin ediyoruz. Ancak 5-iyodoindolün ayrıntılı etki mekanizması henüz belirlenmemiştir.
5-iyodoindolün pratik uygulamasından önce, bitkiler üzerindeki toksik etkisi analiz edilmelidir. Tohum çimlendirme deneylerimiz, 5-iyodoindolün çalışılan konsantrasyonlarda tohum çimlendirme veya sonraki gelişim süreçleri üzerinde olumsuz bir etkisinin olmadığını göstermiştir (Şekil 7). Bu nedenle, bu çalışma, çam nematodlarının çam ağaçlarına olan zararlılığını kontrol etmek için ekolojik ortamda 5-iyodoindol kullanımına bir temel sağlar.
Önceki raporlar, indol bazlı tedavinin antibiyotik direnci ve kanser ilerlemesi sorununu ele almak için potansiyel bir yaklaşım olduğunu göstermiştir55. Ek olarak, indoller antibakteriyel, antikanser, antioksidan, anti-inflamatuar, antidiyabetik, antiviral, antiproliferatif ve antitüberküloz aktivitelere sahiptir ve ilaç geliştirme için umut verici bir temel oluşturabilir56,57. Bu çalışma, ilk kez iyotun antiparaziter ve antihelmintik bir ajan olarak potansiyel kullanımını önermektedir.
Avermektin otuz yıl önce keşfedildi ve 2015'te Nobel Ödülü kazandı ve bir antelmintik olarak kullanımı hala aktif olarak devam ediyor. Ancak, nematodlarda ve böcek zararlılarında avermektinlere karşı direncin hızla gelişmesi nedeniyle, çam ağaçlarında PWN enfeksiyonunu kontrol etmek için alternatif, düşük maliyetli ve çevre dostu bir stratejiye ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma ayrıca 5-iyodoindolün çam nematodlarını öldürme mekanizmasını ve 5-iyodoindolün bitki hücreleri için düşük toksisiteye sahip olduğunu bildirmektedir, bu da gelecekteki ticari uygulamaları için iyi beklentiler sunmaktadır.
Tüm deneyler Kore, Gyeongsan'daki Yeungnam Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı ve yöntemler Yeungnam Üniversitesi Etik Komitesi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
Yumurta kuluçka deneyleri, belirlenmiş prosedürler43 kullanılarak gerçekleştirildi. Yumurtadan çıkma oranlarını (HR) değerlendirmek için, 1 günlük yetişkin nematodlar (yaklaşık 100 dişi ve 100 erkek) mantar içeren Petri kaplarına aktarıldı ve 24 saat büyümeye bırakıldı. Daha sonra yumurtalar izole edildi ve steril damıtılmış suda süspansiyon halinde 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile işlendi. Bu süspansiyonlar (500 μl; yaklaşık 100 yumurta) 24 kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyularına aktarıldı ve 22 °C'de inkübe edildi. L2 sayımları 24 saatlik inkübasyondan sonra yapıldı ancak hücreler ince bir platin tel ile uyarıldığında hareket etmezse ölü olarak kabul edildi. Bu deney, her biri altı tekrarlı olmak üzere iki aşamada gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirildi ve sunuldu. HR yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır:
Larval ölüm oranı daha önce geliştirilen prosedürler kullanılarak değerlendirildi. Nematod yumurtaları toplandı ve embriyolar steril damıtılmış suda çatlatılarak senkronize edildi ve L2 evre larvaları üretildi. Senkronize larvalar (yaklaşık 500 nematod) 5-iyodoindol (0,05 mM ve 0,1 mM) veya avermektin (10 μg/ml) ile muamele edildi ve B. cinerea Petri kaplarında yetiştirildi. 22 °C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra nematodlar steril damıtılmış suda toplandı ve L2, L3 ve L4 evrelerinin varlığı açısından incelendi. L3 ve L4 evrelerinin varlığı larval dönüşümü gösterirken, L2 evresinin varlığı dönüşüm olmadığını gösterdi. Görüntüler iRiS™ Dijital Hücre Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edildi. Bu deney, her biri altı tekrarlı olmak üzere iki aşamada gerçekleştirildi. Her iki deneyden elde edilen veriler birleştirildi ve sunuldu.
5-iyodoindol ve avermektinin tohumlar üzerindeki toksisitesi Murashige ve Skoog agar plakalarında çimlenme testleri kullanılarak değerlendirildi.62 B. oleracea ve R. raphanistrum tohumları önce bir gün boyunca steril damıtılmış suda bekletildi, 1 ml %100 etanol ile yıkandı, 1 ml %50 ticari çamaşır suyu (%3 sodyum hipoklorit) ile 15 dakika sterilize edildi ve beş kez 1 ml steril su ile yıkandı. Sterilize edilen tohumlar daha sonra 0,86 g/l (0,2X) Murashige ve Skoog besiyeri ve 5-iyodoindol veya avermektin içeren veya içermeyen %0,7 bakteriyolojik agar içeren çimlenme agar plakalarına bastırıldı. Plakalar daha sonra 22 °C'de inkübe edildi ve 3 günlük inkübasyondan sonra görüntüler alındı. Bu deney, her biri altı tekrar içeren iki aşamada gerçekleştirildi.
Gönderi zamanı: 26-Şub-2025