Bitki ve patojen materyalleri
Illinois Üniversitesi'nde (şu anda UC Davis'te) Dr. Pat Brown tarafından sorgum dönüşüm popülasyonu (SCP) olarak bilinen bir sorgum ilişki haritalama popülasyonu sağlandı. Daha önce tanımlanmış olup, ABD ortamlarında bitkilerin büyümesini ve gelişimini kolaylaştırmak için fotoperiyot duyarsızlığına ve daha küçük boya dönüştürülen çeşitli hatların bir koleksiyonudur. Bu popülasyondan 510 hat bu çalışmada kullanıldı, ancak kötü çimlenme ve diğer kalite kontrol sorunları nedeniyle, tüm hatlar üç özelliğin analizinde kullanılmadı. Sonuç olarak, 345 hattan gelen veriler kitin tepkisinin analizi için, 472 hat flg22 tepkisi için ve 456 hat TLS direnci için kullanıldı.B. kurabiyeLSLP18 suşu Arkansas Üniversitesi'nden Dr. Burt Bluhm'dan elde edildi.
MAMP tepki ölçümü
Bu çalışmada iki farklı MAMP kullanıldı flg22, (Genscript katalog# RP19986) ve kitin. Sorgum bitkileri serada toprakla doldurulmuş (33% Sunshine Redi-Earth Pro Yetiştirme Karışımı) düzlüklere yerleştirilmiş ek parçalarda yetiştirildi. Bitkiler, toplama gününde ekstra yaprak nemini önlemek için örnek toplamadan önceki gün sulandı.
Hatlar rastgele seçildi ve lojistik nedenlerle 60 hatlık gruplar halinde ekildi. Her hat için, hat başına iki tohum olacak şekilde üç 'saksı' ekildi. Tüm popülasyon değerlendirilene kadar, bir önceki grup işlendikten hemen sonra sonraki gruplar ekildi. Her iki MAMP için iki deneysel çalışma yürütüldü ve her iki çalışmada genotipler yeniden rastgele belirlendi.
ROS analizleri daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Kısaca, her hat için, 3 farklı saksıya altı tohum ekildi. Elde edilen fidelerden, tekdüzeliğe göre üçü seçildi. Sıra dışı görünen veya çoğunluktan önemli ölçüde daha uzun veya daha kısa olan fideler kullanılmadı. Üç farklı 15 günlük sorgum bitkisinin 4. yaprağının en geniş kısmından 3 mm çapında dört yaprak diski çıkarıldı. İki bitkiden yaprak başına bir disk ve bir bitkiden iki disk, ikinci disk su kontrolü oldu (aşağıya bakın). Diskler, siyah 96-kuyucuklu bir plakada 50 µl H20 üzerinde ayrı ayrı yüzdürüldü, ışığa maruz kalmaması için alüminyum bir conta ile kapatıldı ve gece boyunca oda sıcaklığında tutuldu. Ertesi sabah, 2 mg/ml kemilüminesans prob L-012 (Wako, katalog # 120-04891), 2 mg/ml yaban turpu peroksidazı (Tip VI-A, Sigma-Aldrich, katalog # P6782) ve 100 mg/ml Kitin veya 2 μM Flg22 kullanılarak bir reaksiyon solüsyonu hazırlandı. Bu reaksiyon solüsyonundan 50 µl dört kuyudan üçüne eklendi. Dördüncü kuyu, MAMP hariç reaksiyon solüsyonunun eklendiği bir sahte kontroldü. Her plakaya sadece su içeren dört boş kuyu da dahil edildi.
Reaksiyon solüsyonu eklendikten sonra, lüminesans 1 saat boyunca her 2 dakikada bir SynergyTM 2 çoklu algılamalı mikro plaka okuyucusu (BioTek) kullanılarak ölçüldü. Plaka okuyucusu bu 1 saat boyunca her 2 dakikada bir lüminesans ölçümleri alır. Her bir kuyu için değeri elde etmek üzere tüm 31 okumanın toplamı hesaplandı. Her bir genotip için MAMP tepkisi için tahmini değer (üç deneysel kuyunun ortalama lüminesans değeri - sahte kuyu değeri) - ortalama boş kuyu değeri eksi olarak hesaplandı. Boş kuyu değerleri sürekli olarak sıfıra yakındı.
Yaprak diskleriNikotian benthamianaAyrıca, kalite kontrol amaçları doğrultusunda her 96-kuyulu plakaya bir adet yüksek tepkili sorgum hattı (SC0003) ve bir adet düşük tepkili sorgum hattı (PI 6069) kontrol olarak dahil edildi.
B. kurabiyeaşı hazırlama ve aşılama
B. kurabiyeaşı daha önce anlatıldığı gibi hazırlandı. Kısaca, sorgum taneleri üç gün boyunca suda bekletildi, durulandı, 1 L'lik konik şişelere konuldu ve 15 psi ve 121 °C'de bir saat boyunca otoklavlandı. Daha sonra taneler taze bir kültürden yaklaşık 5 ml macerate misel ile aşılandıB. kurabiyeLSLP18 izolatları ve her 3 günde bir şişeleri çalkalayarak oda sıcaklığında 2 hafta bekletildi. 2 hafta sonra, mantar bulaşmış sorgum taneleri hava ile kurutuldu ve daha sonra tarla aşılamasına kadar 4 °C'de saklandı. Aynı aşı tüm deneme boyunca kullanıldı ve her yıl taze yapıldı. Aşılama için, 6-10 bulaşmış tane 4-5 haftalık sorgum bitkilerinin çemberine yerleştirildi. Bu mantarlardan üretilen sporlar bir hafta içinde genç sorgum bitkilerinde enfeksiyon başlattı.
Tohum hazırlama
Tarlaya ekilmeden önce sorgum tohumu, ~%1 Spirato 480 FS fungisidi, %4 Sebring 480 FS fungisidi, %3 Sorpro 940 ES tohum güvenli maddesi içeren bir fungisit, insektisit ve güvenli madde karışımıyla işlendi. Daha sonra tohumlar 3 gün boyunca hava ile kurutuldu ve bu karışım tohumların etrafında ince bir tabaka oluşturdu. Güvenli madde, Dual Magnum herbisidinin çıkış öncesi işlem olarak kullanılmasına olanak sağladı.
Hedef Yaprak Lekesi direncinin değerlendirilmesi
SCP, 14-15 Haziran 2017 ve 20 Haziran 2018 tarihlerinde, her durumda iki deneysel tekrarlama ile rastgele tam blok tasarımında Clayton, NC'deki Central Crops Research Station'a ekildi. Deneyler, parsel başına 10 tohum kullanılarak 0,9 m sıra genişliğinde 1,8 m tek sıralara ekildi. Kenar etkilerini önlemek için her deneyin çevresine iki sınır sırası ekildi. Deneyler, sorgum bitkilerinin 3. büyüme aşamasında olduğu 20 Temmuz 2017 ve 20 Temmuz 2018 tarihlerinde aşılandı. Derecelendirmeler, hastalık belirtisi göstermeyen bitkilerin dokuz, tamamen ölü bitkilerin ise bir olarak puanlandığı bir ila dokuz arası bir ölçekte alındı. Her yıl aşılamadan iki hafta sonra başlamak üzere 2017'de iki derecelendirme ve 2018'de dört okuma alındı. sAUDPC (hastalık ilerleme eğrisi altında kalan standardize alan) daha önce açıklandığı şekilde hesaplandı.
Gönderi zamanı: Nis-01-2021