Bitki ve patojen materyalleri
Sorgum dönüşüm popülasyonu (SCP) olarak bilinen bir sorgum birliği haritalama popülasyonu, Illinois Üniversitesi'nden (şu anda UC Davis'te) Dr. Pat Brown tarafından sağlandı.Daha önce tarif edilmişti ve ABD ortamlarında bitkilerin büyümesini ve gelişmesini kolaylaştırmak için fotoperiyod duyarsızlığına ve daha küçük boylara dönüştürülmüş çeşitli soyların bir koleksiyonudur.Bu çalışmada bu popülasyondan 510 hat kullanıldı, ancak kötü çimlenme ve diğer kalite kontrol sorunlarından dolayı tüm hatlar üç özelliğin analizinde kullanılmadı.Sonuçta kitin yanıtının analizi için 345 hattan, flg22 yanıtı için 472 hattan ve TLS direnci için 456 hattan elde edilen veriler kullanıldı.B. CookeiLSLP18 suşu, Arkansas Üniversitesi'nden Dr. Burt Bluhm'dan elde edildi.
MAMP yanıt ölçümü
Bu çalışmada flg22 (Genscript kataloğu# RP19986) ve chitin olmak üzere iki farklı MAMP kullanıldı.Sorgum bitkileri, serada toprakla (%33 Sunshine Redi-Earth Pro Yetiştirme Karışımı) doldurulmuş düzlüklere yerleştirilen eklerde yetiştirildi.Bitkiler, toplama gününde ekstra yaprak nemini önlemek için numune toplamadan bir gün önce sulandı.
Hatlar rastgele seçildi ve lojistik nedenlerden dolayı 60 hatlık gruplar halinde dikildi.Her sıra için, sıra başına iki tohum olacak şekilde üç 'saksı' ekildi.Sonraki seriler, önceki seri işlenir işlenmez tüm popülasyon değerlendirilene kadar ekildi.Her iki MAMP için de iki çalışmanın her birinde genotiplerin yeniden randomize edildiği iki deneysel çalışma gerçekleştirildi.
ROS analizleri daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirildi.Kısaca her hat için 3 farklı saksıya 6 adet tohum ekilmiştir.Ortaya çıkan fidelerden tekdüzelik esas alınarak üç tane seçildi.Olağandışı görünen veya çoğunluktan önemli ölçüde daha uzun veya daha kısa olan fideler kullanılmadı.15 günlük üç farklı sorgum bitkisinin 4. yaprağının en geniş kısmından 3 mm çapında dört yaprak diski çıkarıldı.İki bitkiden yaprak başına bir disk ve bir bitkiden iki disk; ikinci disk su kontrolü olur (aşağıya bakınız).Diskler, siyah 96 oyuklu bir plaka içinde 50 ul H20 üzerinde ayrı ayrı yüzdürüldü, ışığa maruz kalmamak için alüminyum bir conta ile kapatıldı ve gece boyunca oda sıcaklığında tutuldu.Ertesi sabah 2 mg/ml kemilüminesan prob L-012 (Wako, katalog # 120-04891), 2 mg/ml yaban turpu peroksidazı (Tip VI-A, Sigma-Aldrich, katalog # P6782) kullanılarak bir reaksiyon çözeltisi hazırlandı ve 100 mg/ml Kitin veya 2 μM Flg22.Bu reaksiyon solüsyonunun 50 ul'si dört kuyucuktan üçüne ilave edildi.Dördüncü kuyu, MAMP hariç reaksiyon solüsyonunun eklendiği sahte bir kontroldü.Her plakaya yalnızca su içeren dört boş kuyucuk da dahil edildi.
Reaksiyon solüsyonunun eklenmesinden sonra lüminesans, 1 saat boyunca her 2 dakikada bir SynergyTM 2 çoklu algılamalı mikroplaka okuyucu (BioTek) kullanılarak ölçüldü.Plaka okuyucusu bu 1 saat boyunca her 2 dakikada bir lüminesans ölçümleri alır.Her kuyucuğa ait değeri vermek için 31 okumanın tamamının toplamı hesaplandı.Her bir genotip için MAMP yanıtının tahmini değeri, (üç deneysel kuyucuğun ortalama lüminesans değeri - sahte kuyu değeri) eksi ortalama boş kuyu değeri olarak hesaplandı.Boş kuyucuk değerleri sürekli olarak sıfıra yakındı.
Yaprak diskleriNicotiana benthamiana, bir yüksek tepki veren sorgum hattı (SC0003) ve bir düşük tepki veren sorgum hattı (PI 6069) da kalite kontrol amacıyla her 96 kuyucuklu plakaya kontrol olarak dahil edildi.
B. Cookeiaşı hazırlama ve aşılama
B. Cookeiaşı daha önce açıklandığı gibi hazırlandı.Kısaca, sorgum taneleri üç gün boyunca suya batırılmış, durulanmış, 1 L'lik konik şişelere alınmış ve 15psi ve 121°C'de bir saat boyunca otoklavlanmıştır.Daha sonra taneler, taze bir kültürden elde edilen yaklaşık 5 ml yumuşatılmış misel ile aşılandı.B. CookeiLSLP18 izole edilir ve şişeler her 3 günde bir çalkalanarak 2 hafta boyunca oda sıcaklığında bırakılır.2 hafta sonra, mantarın istila ettiği sorgum taneleri havada kurutuldu ve daha sonra tarla aşılamasına kadar 4 °C'de saklandı.Tüm deneme boyunca aynı aşı kullanıldı ve her yıl taze hale getirildi.Aşılama için, 4-5 haftalık sorgum bitkilerinin sarmalına 6-10 adet istila edilmiş tane yerleştirildi.Bu mantarlardan üretilen sporlar, bir hafta içinde genç sorgum bitkilerinde enfeksiyonu başlatmıştır.
Tohum hazırlama
Tarlaya ekimden önce sorgum tohumuna ~%1 Spirato 480 FS fungisit, %4 Sebring 480 FS fungisit, %3 Sorpro 940 ES tohum koruyucu içeren fungisit, insektisit vesafener karışımı uygulandı.Daha sonra tohumlar 3 gün boyunca havayla kurutuldu ve bu karışımın tohumların etrafında ince bir kaplaması sağlandı.Safener, herbisit Dual Magnum'un ortaya çıkma öncesi bir tedavi olarak kullanılmasına izin verdi.
Hedef Yaprak Lekesi direncinin değerlendirilmesi
SCP, 14-15 Haziran 2017 ve 20 Haziran 2018 tarihlerinde Clayton, NC'deki Merkezi Bitkisel Araştırma İstasyonuna, her durumda iki deneysel kopya içeren rastgele tam blok tasarımıyla dikildi.Denemeler, parsel başına 10 tohum olacak şekilde 0,9 m sıra genişliğinde 1,8 m tek sıra halinde ekilmiştir.Kenar etkilerini önlemek için her deneyin çevresine iki sınır sırası yerleştirildi.Deneyler 20 Temmuz 2017 ve 20 Temmuz 2018'de aşılandı; bu noktada sorgum bitkileri 3. büyüme aşamasındaydı. Derecelendirmeler birden dokuza kadar bir ölçekte alındı; burada hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen bitkiler dokuz olarak puanlandı ve tamamen ölü bitkiler bir olarak puanlandı.Her yıl aşılamadan iki hafta sonra başlayarak 2017'de iki derecelendirme ve 2018'de dört okuma yapıldı.sAUDPC (hastalık ilerleme eğrisi altında standartlaştırılmış alan), daha önce açıklandığı gibi hesaplandı.
Gönderim zamanı: Nis-01-2021