Bitki ve patojen materyalleri
Sorgum dönüşüm popülasyonu (SCP) olarak bilinen bir sorgum ilişki haritalama popülasyonu, Illinois Üniversitesi'nden (şu anda UC Davis'te) Dr. Pat Brown tarafından sağlanmıştır. Daha önce tanımlanmış olan bu popülasyon, ABD ortamlarında bitkilerin büyümesini ve gelişimini kolaylaştırmak için fotoperiyot duyarsızlığına ve daha küçük boya dönüştürülmüş çeşitli hatların bir koleksiyonudur. Bu çalışmada bu popülasyondan 510 hat kullanılmış, ancak kötü çimlenme ve diğer kalite kontrol sorunları nedeniyle, hatların tamamı üç özelliğin analizinde kullanılmamıştır. Sonuç olarak, 345 hattan elde edilen veriler kitin tepkisi, 472 hattan elde edilen veriler flg22 tepkisi ve 456 hattan elde edilen veriler TLS direnci analizi için kullanılmıştır.B. cookeiLSLP18 suşu Arkansas Üniversitesi'nden Dr. Burt Bluhm'dan elde edildi.
MAMP tepki ölçümü
Bu çalışmada iki farklı MAMP kullanıldı: flg22 (Genscript katalog numarası: RP19986) ve kitin. Sorgum bitkileri, serada toprakla doldurulmuş (33% Sunshine Redi-Earth Pro Yetiştirme Karışımı) düzlüklere yerleştirilen ek parçalarda yetiştirildi. Bitkiler, toplama gününde fazla yaprak nemini önlemek için numunelerin toplanmasından bir gün önce sulandı.
Hatlar rastgele seçildi ve lojistik nedenlerle 60 hatlık gruplar halinde ekildi. Her hat için, hat başına iki tohum olacak şekilde üç "saksı" ekildi. Tüm popülasyon değerlendirilene kadar, bir önceki grup işlendikten hemen sonra, sonraki gruplar ekildi. Her iki MAMP için de iki deneysel çalışma yürütüldü ve her iki çalışmada da genotipler yeniden rastgele belirlendi.
ROS analizleri daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Her hat için altı tohum üç farklı saksıya ekildi. Elde edilen fidelerden, tekdüzeliklerine göre üçü seçildi. Sıra dışı görünen veya çoğunluktan önemli ölçüde daha uzun veya kısa olan fideler kullanılmadı. Üç farklı 15 günlük sorgum bitkisinin 4. yaprağının en geniş kısmından 3 mm çapında dört yaprak diski çıkarıldı. İki bitkiden yaprak başına bir disk ve bir bitkiden iki disk olmak üzere ikinci disk su kontrolü olarak kullanıldı (aşağıya bakın). Diskler, siyah 96 kuyucuklu bir plakada 50 µl H2O üzerinde ayrı ayrı yüzdürüldü, ışığa maruz kalmaması için alüminyum bir conta ile kapatıldı ve oda sıcaklığında bir gece bekletildi. Ertesi sabah, 2 mg/ml kemilüminesans prob L-012 (Wako, katalog # 120-04891), 2 mg/ml yaban turpu peroksidazı (Tip VI-A, Sigma-Aldrich, katalog # P6782) ve 100 mg/ml Kitin veya 2 μM Flg22 kullanılarak bir reaksiyon çözeltisi hazırlandı. Bu reaksiyon çözeltisinden 50 μl, dört kuyudan üçüne eklendi. Dördüncü kuyu, MAMP hariç reaksiyon çözeltisinin eklendiği bir sahte kontrol kuyusuydu. Her plakaya yalnızca su içeren dört boş kuyu da eklendi.
Reaksiyon solüsyonu eklendikten sonra, lüminesans, 1 saat boyunca her 2 dakikada bir SynergyTM 2 çoklu algılamalı mikro plaka okuyucu (BioTek) kullanılarak ölçüldü. Plaka okuyucu, bu 1 saat boyunca her 2 dakikada bir lüminesans ölçümleri alır. Her bir kuyucuğun değerini elde etmek için 31 ölçümün toplamı hesaplandı. Her genotip için tahmini MAMP yanıtı değeri, (üç deneysel kuyucuğun ortalama lüminesans değeri - sahte kuyucuk değeri) - ortalama boş kuyucuk değeri çıkarılarak hesaplandı. Boş kuyucuk değerleri sürekli olarak sıfıra yakındı.
Yaprak diskleriNicotiana benthamianaAyrıca, kalite kontrol amacıyla her 96 kuyulu plakaya bir adet yüksek tepkili sorgum hattı (SC0003) ve bir adet düşük tepkili sorgum hattı (PI 6069) kontrol olarak dahil edildi.
B. cookeiaşı hazırlama ve aşılama
B. cookeiAşı, daha önce açıklandığı gibi hazırlandı. Kısaca, sorgum taneleri üç gün boyunca suda bekletildi, durulandı, 1 litrelik konik şişelere konuldu ve 15 psi basınçta ve 121 °C'de bir saat otoklavlandı. Daha sonra, sorgum taneleri taze bir kültürden yaklaşık 5 ml masere edilmiş misel ile aşılandı.B. cookeiLSLP18 izolatları oda sıcaklığında 2 hafta bekletildi ve şişeler 3 günde bir çalkalandı. 2 hafta sonra, mantar bulaşmış sorgum taneleri havada kurutuldu ve tarla aşılamasına kadar 4°C'de saklandı. Aynı aşı tüm deneme boyunca kullanıldı ve her yıl taze olarak hazırlandı. Aşılama için, 4-5 haftalık sorgum bitkilerinin helezonuna 6-10 adet bulaşmış sorgum tanesi yerleştirildi. Bu mantarlardan oluşan sporlar, genç sorgum bitkilerinde bir hafta içinde enfeksiyona neden oldu.
Tohum hazırlama
Tarlaya ekimden önce sorgum tohumları, yaklaşık %1 Spirato 480 FS fungisit, %4 Sebring 480 FS fungisit ve %3 Sorpro 940 ES tohum koruyucu içeren bir fungisit, insektisit ve koruyucu karışımıyla muamele edildi. Daha sonra tohumlar 3 gün boyunca hava ile kurutuldu ve bu karışım tohumların etrafında ince bir tabaka oluşturdu. Koruyucu karışım, Dual Magnum herbisitinin çıkış öncesi ilaç olarak kullanılmasına olanak sağladı.
Hedef Yaprak Lekesi direncinin değerlendirilmesi
SCP, 14-15 Haziran 2017 ve 20 Haziran 2018 tarihlerinde Clayton, NC'deki Merkezi Mahsul Araştırma İstasyonu'nda, her durumda iki deneysel tekrarlama ile rastgele tam blok tasarımında ekildi. Deneyler, parsel başına 10 tohum kullanılarak 0,9 m sıra genişliğine sahip 1,8 m tek sıralara ekildi. Kenar etkilerini önlemek için her deneyin çevresine iki sınır sırası ekildi. Deneyler, sorgum bitkilerinin 3. büyüme aşamasında olduğu 20 Temmuz 2017 ve 20 Temmuz 2018'de aşılandı. Derecelendirmeler, hastalık belirtisi göstermeyen bitkilerin dokuz, tamamen ölü bitkilerin ise bir olarak puanlandığı bir ila dokuz arasında bir ölçekte alındı. Her yıl aşılamadan iki hafta sonra başlamak üzere 2017'de iki derecelendirme ve 2018'de dört okuma alındı. sAUDPC (hastalık ilerleme eğrisi altında kalan standardize alan) daha önce açıklandığı gibi hesaplandı.
Gönderi zamanı: 01 Nis 2021