Guizhou Eyaletinde yağışın mevsimsel dağılımı düzensizdir, ilkbahar ve yaz aylarında daha fazla yağış olur, ancak kolza tohumu fideleri sonbahar ve kış aylarında kuraklık stresine karşı hassastır ve bu da verimi ciddi şekilde etkiler. Hardal, esas olarak Guizhou Eyaletinde yetiştirilen özel bir yağ tohumu ürünüdür. Güçlü kuraklık toleransına sahiptir ve dağlık alanlarda yetiştirilebilir. Kuraklığa dayanıklı genlerin zengin bir kaynağıdır. Kuraklığa dayanıklı genlerin keşfi, hardal çeşitlerinin iyileştirilmesi ve germ plazma kaynaklarında yenilik için kritik öneme sahiptir. GRF ailesi, bitki büyümesinde ve gelişiminde ve kuraklık stresine verilen yanıtta kritik bir rol oynar. Şu anda, GRF genleri Arabidopsis 2, pirinç (Oryza sativa) 12, kolza tohumu 13, pamuk (Gossypium hirsutum) 14, buğdayda (Triticum. aestivum) 15, inci darı (Setaria italica) 16 ve Brassica'da 17 bulunmuştur, ancak hardalda GRF genlerinin tespit edildiğine dair hiçbir rapor yoktur. Bu çalışmada hardalın GRF ailesi genleri genom çapında tanımlandı ve fiziksel ve kimyasal özellikleri, evrimsel ilişkileri, homolojileri, korunan motifleri, gen yapıları, gen duplikasyonları, cis-elementleri ve fide aşaması (dört yapraklı aşama) analiz edildi. Kuraklık stresi altındaki ifade kalıpları, kuraklık tepkisinde BjGRF genlerinin potansiyel işlevi üzerine daha ileri çalışmalar için bilimsel bir temel sağlamak ve kuraklığa dayanıklı hardal yetiştirmek için aday genler sağlamak amacıyla kapsamlı bir şekilde analiz edildi.
İki HMMER araması kullanılarak Brassica juncea genomunda otuz dört BjGRF geni tanımlandı; bunların hepsi QLQ ve WRC alanlarını içerir. Tanımlanan BjGRF genlerinin CDS dizileri Ek Tablo S1'de sunulmaktadır. BjGRF01–BjGRF34, kromozomdaki konumlarına göre adlandırılır. Bu ailenin fizikokimyasal özellikleri, amino asit uzunluğunun 261 aa (BjGRF19) ile 905 aa (BjGRF28) arasında değişerek oldukça değişken olduğunu göstermektedir. BjGRF'nin izoelektrik noktası 6,19 (BjGRF02) ile 9,35 (BjGRF03) arasında değişmektedir ve ortalaması 8,33'tür ve BjGRF'nin %88,24'ü bazik bir proteindir. BjGRF'nin öngörülen moleküler ağırlık aralığı 29,82 kDa (BjGRF19) ile 102,90 kDa (BjGRF28) arasındadır; BjGRF proteinlerinin kararsızlık indeksi 51,13 (BjGRF08) ile 78,24 (BjGRF19) arasında değişir, hepsi 40'tan büyüktür, bu da yağ asidi indeksinin 43,65 (BjGRF01) ile 78,78 (BjGRF22) arasında değiştiğini, ortalama hidrofilisitenin (GRAVY) -1,07 (BjGRF31) ile -0,45 (BjGRF22) arasında değiştiğini, tüm hidrofilik BjGRF proteinlerinin negatif GRAVY değerlerine sahip olduğunu, bunun kalıntıların neden olduğu hidrofobisite eksikliğinden kaynaklanabileceğini göstermektedir. Hücre içi lokalizasyon tahmini, 31 BjGRF kodlu proteinin çekirdekte, BjGRF04'ün peroksizomlarda, BjGRF25'in sitoplazmada ve BjGRF28'in kloroplastlarda lokalize olabileceğini gösterdi (Tablo 1), bu da BjGRF'lerin çekirdekte lokalize olabileceğini ve bir transkripsiyon faktörü olarak önemli bir düzenleyici rol oynayabileceğini göstermektedir.
Farklı türlerdeki GRF ailelerinin filogenetik analizi gen fonksiyonlarının incelenmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, 35 kolza tohumu, 16 şalgam, 12 pirinç, 10 darı ve 9 Arabidopsis GRF'sinin tam uzunluktaki amino asit dizileri indirildi ve 34 tanımlanmış BjGRF genine dayalı bir filogenetik ağaç oluşturuldu (Şekil 1). Üç alt familya farklı sayıda üye içerir; 116 GRF TF'si üç farklı alt familyaya (gruplar A~C) ayrılmıştır ve sırasıyla GRF'lerin %59'unu (%50,86), %34'ünü (%29,31) ve %23'ünü (%19,83) içerir. Bunlar arasında 34 BjGRF aile üyesi 3 alt familyaya dağılmıştır: Grup A'da 13 üye (%38,24), grup B'de 12 üye (%35,29) ve grup C'de 9 üye (%26,47). Hardal poliploidizasyonu sürecinde, farklı alt ailelerdeki BjGRF genlerinin sayısı farklıdır ve gen amplifikasyonu ve kaybı meydana gelmiş olabilir. Grup C'de pirinç ve darı GRF'lerinin dağılımının olmaması, grup B'de ise 2 pirinç GRF'si ve 1 darı GRF'si olması ve pirinç ve darı GRF'lerinin çoğunun tek bir dalda gruplanmış olması, BjGRF'lerin dikotiledonlarla yakın ilişkili olduğunu göstermektedir. Bunlar arasında, Arabidopsis thaliana'daki GRF işlevine ilişkin en derinlemesine çalışmalar, BjGRF'lerin işlevsel çalışmaları için bir temel sağlar.
Brassica napus, Brassica napus, pirinç, darı ve Arabidopsis thaliana GRF ailesinin üyelerini içeren hardalın filogenetik ağacı.
Hardal GRF ailesindeki tekrarlayan genlerin analizi. Arka plandaki gri çizgi hardal genomunda senkronize bir bloğu temsil eder, kırmızı çizgi BjGRF geninin bir çift segmentli tekrarını temsil eder;
Dördüncü yaprak evresinde kuraklık stresi altında BjGRF gen ifadesi. qRT-PCR verileri Ek Tablo S5'te gösterilmiştir. Verilerdeki önemli farklılıklar küçük harflerle gösterilmiştir.
Küresel iklim değişmeye devam ederken, mahsullerin kuraklık stresiyle nasıl başa çıktığı ve tolerans mekanizmalarını nasıl geliştirdiği üzerine çalışmalar yapmak sıcak bir araştırma konusu haline gelmiştir18. Kuraklıktan sonra, bitkilerin morfolojik yapısı, gen ifadesi ve metabolik süreçleri değişecektir, bu da fotosentezin durmasına ve metabolik bozulmaya yol açarak mahsulün verimini ve kalitesini etkileyebilir19,20,21. Bitkiler kuraklık sinyallerini algıladıklarında, Ca2+ ve fosfatidilinositol gibi ikinci haberciler üretir, hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunu artırır ve protein fosforilasyon yolunun düzenleyici ağını aktive eder22,23. Son hedef protein doğrudan hücresel savunmada yer alır veya TF'ler aracılığıyla ilgili stres genlerinin ifadesini düzenleyerek bitkinin strese toleransını artırır24,25. Bu nedenle, TF'ler kuraklık stresine yanıt vermede önemli bir rol oynar. Kuraklık stresine duyarlı TF'lerin dizilim ve DNA bağlanma özelliklerine göre GRF, ERF, MYB, WRKY ve diğer familyalar gibi farklı familyalara ayrılabilir26.
GRF gen ailesi, büyüme, gelişme, sinyal iletimi ve bitki savunma yanıtları gibi çeşitli yönlerde önemli roller oynayan bir tür bitkiye özgü TF'dir27. İlk GRF geni O. sativa'da tanımlandığından beri28, birçok türde giderek daha fazla GRF geni tanımlanmış ve bitki büyümesi, gelişimi ve stres yanıtını etkilediği gösterilmiştir8, 29, 30,31,32. Brassica juncea genom dizisinin yayınlanmasıyla BjGRF gen ailesinin tanımlanması mümkün hale geldi33. Bu çalışmada, tüm hardal genomunda 34 BjGRF geni tanımlanmış ve kromozomal pozisyonlarına göre BjGRF01–BjGRF34 olarak adlandırılmıştır. Hepsi yüksek oranda korunmuş QLQ ve WRC alanları içerir. Fizikokimyasal özelliklerin analizi, BjGRF proteinlerinin (BjGRF28 hariç) amino asit sayıları ve moleküler ağırlıklarındaki farklılıkların önemli olmadığını, bu da BjGRF ailesi üyelerinin benzer işlevlere sahip olabileceğini göstermiştir. Gen yapısı analizi, BjGRF genlerinin %64,7'sinin 4 ekzon içerdiğini gösterdi. Bu, BjGRF gen yapısının evrimde nispeten korunduğunu, ancak BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ve BjGRF29 genlerindeki ekzon sayısının daha fazla olduğunu göstermektedir. Çalışmalar, ekzon veya intronların eklenmesi veya silinmesinin gen yapısı ve işlevinde farklılıklara yol açabileceğini ve böylece yeni genler oluşturabileceğini göstermiştir34,35,36. Bu nedenle, BjGRF intronunun evrim sırasında kaybolduğunu ve bunun gen işlevinde değişikliklere neden olabileceğini tahmin ediyoruz. Mevcut çalışmalarla tutarlı olarak, intron sayısının gen ifadesiyle ilişkili olduğunu da bulduk. Bir gendeki intron sayısı fazla olduğunda, gen çeşitli olumsuz faktörlere hızla yanıt verebilir.
Gen duplikasyonu genomik ve genetik evrimde önemli bir faktördür37. İlgili çalışmalar gen duplikasyonunun sadece GRF genlerinin sayısını artırmakla kalmayıp aynı zamanda bitkilerin çeşitli olumsuz çevre koşullarına uyum sağlamasına yardımcı olmak için yeni genler üretme aracı olarak da hizmet ettiğini göstermiştir38. Bu çalışmada toplam 48 adet yinelenen gen çifti bulunmuştur ve bunların hepsi segmental duplikasyonlardır. Bu da segmental duplikasyonların bu ailedeki gen sayısını artırmak için ana mekanizma olduğunu göstermektedir. Literatürde segmental duplikasyonun Arabidopsis ve çilekte GRF gen ailesi üyelerinin çoğalmasını etkili bir şekilde destekleyebildiği bildirilmiştir ve bu gen ailesinin hiçbir türünde tandem duplikasyonuna rastlanmamıştır27,39. Bu çalışmanın sonuçları Arabidopsis thaliana ve çilek aileleri üzerinde yapılan mevcut çalışmalarla tutarlıdır ve GRF ailesinin farklı bitkilerde segmental duplikasyon yoluyla gen sayısını artırabileceğini ve yeni genler üretebileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmada hardalda toplam 34 BjGRF geni tanımlanmış ve bunlar 3 alt familyaya ayrılmıştır. Bu genler benzer korunmuş motifler ve gen yapıları göstermiştir. Kolinearite analizi hardalda 48 çift segment duplikasyonu olduğunu ortaya koymuştur. BjGRF promotör bölgesi ışık tepkisi, hormonal tepki, çevresel stres tepkisi ve büyüme ve gelişme ile ilişkili cis etkili elementler içerir. 34 BjGRF geninin ifadesi hardal fide aşamasında (kökler, gövdeler, yapraklar) ve kuraklık koşulları altında 10 BjGRF geninin ifade örüntüsü tespit edilmiştir. Kuraklık stresi altındaki BjGRF genlerinin ifade örüntülerinin benzer olduğu ve benzer olabileceği bulunmuştur. Kuraklık Zorlamasının düzenlenmesinde rol oynama. BjGRF03 ve BjGRF32 genleri kuraklık stresinde pozitif düzenleyici roller oynayabilirken, BjGRF06 ve BjGRF23 kuraklık stresinde miR396 hedef genleri olarak rol oynar. Genel olarak çalışmamız, Brassicaceae bitkilerinde BjGRF gen fonksiyonunun gelecekte keşfedilmesi için biyolojik bir temel sunmaktadır.
Bu deneyde kullanılan hardal tohumları Guizhou Tarım Bilimleri Akademisi, Guizhou Yağ Tohumu Araştırma Enstitüsü tarafından sağlandı. Tüm tohumları seçin ve toprağa ekin (substrat: toprak = 3:1) ve dört yapraklı aşamadan sonra kökleri, gövdeleri ve yaprakları toplayın. Bitkiler kuraklığı simüle etmek için %20 PEG 6000 ile muamele edildi ve yapraklar 0, 3, 6, 12 ve 24 saat sonra toplandı. Tüm bitki örnekleri hemen sıvı nitrojende donduruldu ve ardından bir sonraki test için -80°C'lik bir dondurucuda saklandı.
Bu çalışma sırasında elde edilen veya analiz edilen tüm veriler yayınlanan makale ve ek bilgi dosyalarında yer almaktadır.
Gönderi zamanı: 22-Oca-2025