Guizhou Eyaletinde yağışın mevsimsel dağılımı düzensizdir; ilkbahar ve yaz aylarında daha fazla yağış görülür, ancak kolza fideleri sonbahar ve kış aylarında kuraklık stresine maruz kalır ve bu da verimi ciddi şekilde etkiler. Hardal, esas olarak Guizhou Eyaletinde yetiştirilen özel bir yağ tohumu ürünüdür. Güçlü kuraklığa dayanıklıdır ve dağlık alanlarda yetiştirilebilir. Kuraklığa dayanıklı genler açısından zengin bir kaynaktır. Kuraklığa dayanıklı genlerin keşfi, hardal çeşitlerinin iyileştirilmesi ve germ plazma kaynaklarında yenilik için kritik öneme sahiptir. GRF ailesi, bitki büyümesinde ve gelişmesinde ve kuraklık stresine verilen yanıtta kritik bir rol oynar. Şu anda, GRF genleri Arabidopsis 2, pirinç (Oryza sativa) 12, kolza tohumu 13, pamuk (Gossypium hirsutum) 14, buğday (Triticum. aestivum) 15, inci darısı (Setaria italica) 16 ve Brassica'da 17 bulunmuştur, ancak hardalda GRF genlerinin tespit edildiğine dair herhangi bir rapor yoktur. Bu çalışmada, hardalın GRF ailesi genleri genom çapında tanımlanmış ve fiziksel ve kimyasal özellikleri, evrimsel ilişkileri, homolojileri, korunan motifleri, gen yapıları, gen duplikasyonları, cis elementleri ve fide evresi (dört yapraklı evre) analiz edilmiştir. Kuraklık stresi altındaki ifade örüntüleri, BjGRF genlerinin kuraklık tepkisindeki potansiyel işlevleri üzerine daha ileri çalışmalar için bilimsel bir temel oluşturmak ve kuraklığa dayanıklı hardal yetiştiriciliği için aday genler sağlamak amacıyla kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir.
Brassica juncea genomunda, tamamı QLQ ve WRC bölgelerini içeren iki HMMER araması kullanılarak otuz dört BjGRF geni tanımlanmıştır. Tanımlanan BjGRF genlerinin CDS dizileri Ek Tablo S1'de sunulmaktadır. BjGRF01–BjGRF34, kromozomdaki konumlarına göre adlandırılmıştır. Bu ailenin fizikokimyasal özellikleri, amino asit uzunluğunun 261 aa (BjGRF19) ile 905 aa (BjGRF28) arasında oldukça değişken olduğunu göstermektedir. BjGRF'nin izoelektrik noktası 6,19 (BjGRF02) ile 9,35 (BjGRF03) arasında değişmekte olup, ortalaması 8,33'tür ve BjGRF'nin %88,24'ü bazik bir proteindir. BjGRF'nin tahmini moleküler ağırlık aralığı 29,82 kDa (BjGRF19) ile 102,90 kDa (BjGRF28) arasındadır; BjGRF proteinlerinin kararsızlık indeksi 51,13 (BjGRF08) ile 78,24 (BjGRF19) arasında değişir, hepsi 40'tan büyüktür, bu da yağ asidi indeksinin 43,65 (BjGRF01) ile 78,78 (BjGRF22) arasında değiştiğini, ortalama hidrofilisitenin (GRAVY) -1,07 (BjGRF31) ile -0,45 (BjGRF22) arasında değiştiğini, tüm hidrofilik BjGRF proteinlerinin negatif GRAVY değerlerine sahip olduğunu, bunun kalıntıların neden olduğu hidrofobisite eksikliğinden kaynaklanabileceğini göstermektedir. Hücre altı lokalizasyon tahmini, 31 BjGRF kodlu proteinin çekirdekte, BjGRF04'ün peroksisomlarda, BjGRF25'in sitoplazmada ve BjGRF28'in kloroplastlarda lokalize olabileceğini gösterdi (Tablo 1), bu da BjGRF'lerin çekirdekte lokalize olabileceğini ve bir transkripsiyon faktörü olarak önemli bir düzenleyici rol oynayabileceğini göstermektedir.
Farklı türlerdeki GRF ailelerinin filogenetik analizi gen fonksiyonlarının incelenmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, 35 kanola, 16 şalgam, 12 pirinç, 10 darı ve 9 Arabidopsis GRF'sinin tam uzunluktaki amino asit dizileri indirildi ve 34 tanımlanmış BjGRF genine dayalı bir filogenetik ağaç oluşturuldu (Şekil 1). Üç alt familya farklı sayıda üye içerir; 116 GRF TF'si üç farklı alt familyaya (gruplar A~C) ayrılmıştır ve sırasıyla GRF'lerin 59'unu (%50,86), 34'ünü (%29,31) ve 23'ünü (%19,83) içerir. Bunlar arasında 34 BjGRF familyası üyesi 3 alt familyaya dağılmıştır: A grubunda 13 üye (%38,24), B grubunda 12 üye (%35,29) ve C grubunda 9 üye (%26,47). Hardal poliploidizasyonu sürecinde, farklı alt familyalardaki BjGRF genlerinin sayısı farklıdır ve gen amplifikasyonu ve kaybı meydana gelmiş olabilir. C grubunda pirinç ve darı GRF'lerinin dağılımının olmaması, B grubunda ise 2 pirinç GRF'si ve 1 darı GRF'si bulunması ve pirinç ve darı GRF'lerinin çoğunun tek bir dalda gruplanmış olması, BjGRF'lerin dikotiledonlarla yakın akraba olduğunu göstermektedir. Bunlar arasında, Arabidopsis thaliana'daki GRF işlevi üzerine yapılmış en derinlemesine çalışmalar, BjGRF'lerin işlevsel çalışmaları için bir temel oluşturmaktadır.
Brassica napus, Brassica napus, pirinç, darı ve Arabidopsis thaliana GRF familyasının üyelerini içeren hardalın filogenetik ağacı.
Hardal bitkisi GRF ailesindeki tekrarlayan genlerin analizi. Arka plandaki gri çizgi, hardal genomundaki senkronize bir bloğu, kırmızı çizgi ise BjGRF geninin segmentli tekrarlarından oluşan bir çifti temsil etmektedir;
Dördüncü yaprak evresinde kuraklık stresi altında BjGRF gen ekspresyonu. qRT-PCR verileri Ek Tablo S5'te gösterilmiştir. Verilerdeki anlamlı farklılıklar küçük harflerle gösterilmiştir.
Küresel iklim değişmeye devam ettikçe, bitkilerin kuraklık stresiyle nasıl başa çıktığı ve tolerans mekanizmalarını nasıl geliştirdikleri üzerine çalışmalar sıcak bir araştırma konusu haline gelmiştir18. Kuraklıktan sonra bitkilerin morfolojik yapısı, gen ifadesi ve metabolik süreçleri değişecektir; bu da fotosentezin durmasına ve metabolik bozulmaya yol açarak bitkilerin verimini ve kalitesini etkileyebilir19,20,21. Bitkiler kuraklık sinyallerini algıladıklarında Ca2+ ve fosfatidilinositol gibi ikinci haberciler üretirler, hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunu artırırlar ve protein fosforilasyon yolunun düzenleyici ağını aktive ederler22,23. Son hedef protein doğrudan hücresel savunmada yer alır veya TF'ler aracılığıyla ilgili stres genlerinin ifadesini düzenleyerek bitkinin strese toleransını artırır24,25. Bu nedenle, TF'ler kuraklık stresine yanıt vermede önemli bir rol oynarlar. Kuraklık stresine duyarlı TF'lerin dizilimi ve DNA bağlanma özelliklerine göre GRF, ERF, MYB, WRKY ve diğer familyalar gibi farklı familyalara ayrılabilir26.
GRF gen ailesi, büyüme, gelişme, sinyal iletimi ve bitki savunma yanıtları gibi çeşitli yönlerde önemli roller oynayan bir tür bitkiye özgü TF'dir27. İlk GRF geni O. sativa'da tanımlandığından beri28, birçok türde giderek daha fazla GRF geni tanımlanmış ve bitki büyümesini, gelişimini ve stres yanıtını etkilediği gösterilmiştir8, 29, 30,31,32. Brassica juncea genom dizisinin yayınlanmasıyla BjGRF gen ailesinin tanımlanması mümkün hale geldi33. Bu çalışmada, tüm hardal genomunda 34 BjGRF geni tanımlanmış ve kromozomal pozisyonlarına göre BjGRF01–BjGRF34 olarak adlandırılmıştır. Hepsi yüksek oranda korunmuş QLQ ve WRC alanları içerir. Fizikokimyasal özelliklerin analizi, BjGRF proteinlerinin (BjGRF28 hariç) amino asit sayıları ve molekül ağırlıklarındaki farklılıkların önemli olmadığını, BjGRF ailesi üyelerinin benzer işlevlere sahip olabileceğini göstermiştir. Gen yapısı analizi, BjGRF genlerinin %64,7'sinin 4 ekzon içerdiğini gösterdi. Bu, BjGRF gen yapısının evrimde nispeten korunduğunu, ancak BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ve BjGRF29 genlerindeki ekzon sayısının daha fazla olduğunu göstermektedir. Çalışmalar, ekzonların veya intronların eklenmesi veya silinmesinin gen yapısı ve işlevinde farklılıklara yol açabileceğini ve böylece yeni genler oluşturabileceğini göstermiştir34,35,36. Bu nedenle, BjGRF'nin intronunun evrim sırasında kaybolduğunu ve bunun gen işlevinde değişikliklere neden olabileceğini tahmin ediyoruz. Mevcut çalışmalarla tutarlı olarak, intron sayısının gen ifadesiyle ilişkili olduğunu da bulduk. Bir gendeki intron sayısı fazla olduğunda, gen çeşitli olumsuz faktörlere hızla yanıt verebilir.
Gen duplikasyonu genomik ve genetik evrimde önemli bir faktördür37. İlgili çalışmalar gen duplikasyonunun sadece GRF genlerinin sayısını artırmakla kalmayıp aynı zamanda bitkilerin çeşitli olumsuz çevre koşullarına uyum sağlamasına yardımcı olan yeni genler üretme aracı olarak da hizmet ettiğini göstermiştir38. Bu çalışmada toplam 48 yinelenen gen çifti bulundu, hepsi segmental duplikasyonlardı ve bu da segmental duplikasyonların bu ailedeki gen sayısını artırmak için ana mekanizma olduğunu göstermektedir. Literatürde segmental duplikasyonun Arabidopsis ve çilekte GRF gen ailesi üyelerinin çoğalmasını etkili bir şekilde destekleyebileceği bildirilmiş olup bu gen ailesinin hiçbir türünde tandem duplikasyonuna rastlanmamıştır27,39. Bu çalışmanın sonuçları Arabidopsis thaliana ve çilek aileleri üzerinde yapılan mevcut çalışmalarla tutarlıdır ve GRF ailesinin gen sayısını artırabileceğini ve farklı bitkilerde segmental duplikasyon yoluyla yeni genler üretebileceğini düşündürmektedir.
Bu çalışmada hardalda toplam 34 BjGRF geni tanımlanmış ve bunlar 3 alt familyaya ayrılmıştır. Bu genler benzer korunmuş motifler ve gen yapıları göstermiştir. Kolinearite analizi hardalda 48 çift segment duplikasyonu olduğunu ortaya koymuştur. BjGRF promotör bölgesi ışık tepkisi, hormonal tepki, çevresel stres tepkisi ve büyüme ve gelişme ile ilişkili cis etkili elementler içerir. 34 BjGRF geninin ifadesi hardal fide aşamasında (kökler, gövdeler, yapraklar) ve kuraklık koşulları altında 10 BjGRF geninin ifade örüntüsü tespit edilmiştir. Kuraklık stresi altındaki BjGRF genlerinin ifade örüntülerinin benzer olduğu ve benzer olabileceği bulunmuştur. Kuraklık Zorlaması düzenlemesinde rol oynama. BjGRF03 ve BjGRF32 genleri kuraklık stresinde pozitif düzenleyici roller oynayabilirken, BjGRF06 ve BjGRF23 miR396 hedef genleri olarak kuraklık stresinde rol oynar. Genel olarak çalışmamız, Brassicaceae bitkilerinde BjGRF gen fonksiyonunun gelecekte keşfedilmesi için biyolojik bir temel sağlamaktadır.
Bu deneyde kullanılan hardal tohumları, Guizhou Tarım Bilimleri Akademisi, Guizhou Yağ Tohumu Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır. Tohumların tamamını seçip toprağa ekin (substrat: toprak = 3:1) ve dört yapraklı dönemden sonra kökleri, gövdeleri ve yaprakları toplayın. Bitkiler kuraklığı simüle etmek için %20'lik PEG 6000 ile muamele edildi ve yapraklar 0, 3, 6, 12 ve 24 saat sonra toplandı. Tüm bitki örnekleri hemen sıvı nitrojende dondurularak bir sonraki test için -80°C'lik bir dondurucuda saklandı.
Bu çalışma sırasında elde edilen veya analiz edilen tüm veriler yayınlanan makale ve ek bilgi dosyalarında yer almaktadır.
Gönderi zamanı: 22 Ocak 2025