Guizhou Eyaleti'nde yağışın mevsimsel dağılımı düzensizdir; ilkbahar ve yaz aylarında daha fazla yağış görülür, ancak kolza fideleri sonbahar ve kış aylarında kuraklık stresine karşı hassastır ve bu da verimi ciddi şekilde etkiler. Hardal, esas olarak Guizhou Eyaleti'nde yetiştirilen özel bir yağlı tohum bitkisidir. Güçlü kuraklık toleransına sahiptir ve dağlık bölgelerde yetiştirilebilir. Kuraklığa dayanıklı genler açısından zengin bir kaynaktır. Kuraklığa dayanıklı genlerin keşfi, hardal çeşitlerinin iyileştirilmesi ve genetik kaynaklarda yenilik için kritik öneme sahiptir. GRF ailesi, bitki büyüme ve gelişmesinde ve kuraklık stresine yanıt vermede kritik bir rol oynar. Şu anda, GRF genleri Arabidopsis 2, pirinç (Oryza sativa) 12, kolza 13, pamuk (Gossypium hirsutum) 14, buğday (Triticum aestivum) 15, inci darı (Setaria italica) 16 ve Brassica 17'de bulunmuştur, ancak hardalda tespit edilen GRF genlerine dair herhangi bir rapor bulunmamaktadır. Bu çalışmada, hardalın GRF ailesi genleri genom çapında tanımlanmış ve fiziksel ve kimyasal özellikleri, evrimsel ilişkileri, homolojisi, korunmuş motifleri, gen yapısı, gen duplikasyonları, cis-elementleri ve fide aşaması (dört yapraklı aşama) analiz edilmiştir. Kuraklık stresi altındaki ifade kalıpları kapsamlı bir şekilde analiz edilerek, BjGRF genlerinin kuraklık tepkisindeki potansiyel işlevi üzerine yapılacak daha ileri çalışmalar için bilimsel bir temel sağlanmış ve kuraklığa dayanıklı hardal ıslahı için aday genler belirlenmiştir.
Brassica juncea genomunda iki HMMER araması kullanılarak otuz dört BjGRF geni tanımlandı ve bunların tümü QLQ ve WRC alanlarını içeriyor. Tanımlanan BjGRF genlerinin CDS dizileri Ek Tablo S1'de sunulmuştur. BjGRF01–BjGRF34, kromozom üzerindeki konumlarına göre adlandırılmıştır. Bu ailenin fizikoşimik özellikleri, amino asit uzunluğunun oldukça değişken olduğunu ve 261 aa (BjGRF19) ile 905 aa (BjGRF28) arasında değiştiğini göstermektedir. BjGRF'nin izoelektrik noktası 6,19 (BjGRF02) ile 9,35 (BjGRF03) arasında değişmekte olup ortalama 8,33'tür ve BjGRF'nin %88,24'ü bazik bir proteindir. BjGRF'nin tahmini moleküler ağırlık aralığı 29,82 kDa (BjGRF19) ile 102,90 kDa (BjGRF28) arasındadır; BjGRF proteinlerinin kararsızlık indeksi 51,13 (BjGRF08) ile 78,24 (BjGRF19) arasında değişmekte olup, hepsi 40'tan büyüktür; bu da yağ asidi indeksinin 43,65 (BjGRF01) ile 78,78 (BjGRF22) arasında değiştiğini göstermektedir; ortalama hidrofilite (GRAVY) -1,07 (BjGRF31) ile -0,45 (BjGRF22) arasında değişmektedir; tüm hidrofilik BjGRF proteinlerinin negatif GRAVY değerlerine sahip olması, kalıntıların neden olduğu hidrofobiklik eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Hücre altı lokalizasyon tahmini, 31 BjGRF kodlu proteinin çekirdekte, BjGRF04'ün peroksizomlarda, BjGRF25'in sitoplazmada ve BjGRF28'in kloroplastlarda lokalize olabileceğini göstermiştir (Tablo 1). Bu da BjGRF'lerin çekirdekte lokalize olabileceğini ve transkripsiyon faktörü olarak önemli bir düzenleyici rol oynayabileceğini göstermektedir.
Farklı türlerdeki GRF ailelerinin filogenetik analizi, gen fonksiyonlarının incelenmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, 35 kolza, 16 şalgam, 12 pirinç, 10 darı ve 9 Arabidopsis GRF'sinin tam uzunluktaki amino asit dizileri indirildi ve tanımlanan 34 BjGRF genine dayalı bir filogenetik ağaç oluşturuldu (Şekil 1). Üç alt aile farklı sayıda üye içermektedir; 116 GRF TF, sırasıyla GRF'lerin %59'unu (%50,86), %34'ünü (%29,31) ve %23'ünü (%19,83) içeren üç farklı alt aileye (A~C grupları) ayrılmıştır. Bunlar arasında, 34 BjGRF aile üyesi 3 alt aileye dağılmıştır: A grubunda 13 üye (%38,24), B grubunda 12 üye (%35,29) ve C grubunda 9 üye (%26,47). Hardalın poliploidizasyon sürecinde, farklı alt ailelerdeki BjGRF genlerinin sayısı farklıdır ve gen amplifikasyonu ve kaybı meydana gelmiş olabilir. C grubunda pirinç ve darı GRF'lerinin dağılımının olmaması, B grubunda ise 2 pirinç GRF'si ve 1 darı GRF'sinin bulunması ve pirinç ve darı GRF'lerinin çoğunun tek bir dalda gruplanması, BjGRF'lerin dikotlarla yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Bunlar arasında, Arabidopsis thaliana'daki GRF fonksiyonu üzerine yapılan en kapsamlı çalışmalar, BjGRF'lerin fonksiyonel çalışmaları için bir temel oluşturmaktadır.
Brassica napus, Brassica napus, pirinç, darı ve Arabidopsis thaliana GRF ailesinin üyelerini içeren hardalın filogenetik ağacı.
Hardal GRF ailesindeki tekrarlayan genlerin analizi. Arka plandaki gri çizgi, hardal genomunda senkronize bir bloğu, kırmızı çizgi ise BjGRF geninin parçalı tekrarlarından oluşan bir çifti temsil etmektedir;
Dördüncü yaprak evresinde kuraklık stresi altında BjGRF gen ekspresyonu. qRT-PCR verileri Ek Tablo S5'te gösterilmiştir. Verilerdeki önemli farklılıklar küçük harflerle belirtilmiştir.
Küresel iklim değişikliği devam ederken, bitkilerin kuraklık stresiyle nasıl başa çıktığı ve tolerans mekanizmalarının nasıl geliştirildiği üzerine yapılan çalışmalar, güncel bir araştırma konusu haline gelmiştir.18 Kuraklıktan sonra, bitkilerin morfolojik yapısı, gen ekspresyonu ve metabolik süreçleri değişir; bu da fotosentezin durmasına ve metabolik bozulmaya yol açarak ürün verimini ve kalitesini etkileyebilir.19,20,21 Bitkiler kuraklık sinyallerini algıladıklarında, Ca2+ ve fosfatidilinositol gibi ikincil haberciler üretir, hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunu artırır ve protein fosforilasyon yolunun düzenleyici ağını aktive eder.22,23 Son hedef protein, doğrudan hücresel savunmaya katılır veya transkripsiyon faktörleri (TF'ler) aracılığıyla ilgili stres genlerinin ekspresyonunu düzenleyerek bitkinin strese karşı toleransını artırır.24,25 Bu nedenle, TF'ler kuraklık stresine yanıt vermede çok önemli bir rol oynar. Kuraklık stresi tepkisi veren transkripsiyon faktörlerinin dizi ve DNA bağlama özelliklerine göre, transkripsiyon faktörleri GRF, ERF, MYB, WRKY ve diğer aileler gibi farklı ailelere ayrılabilir.
GRF gen ailesi, büyüme, gelişme, sinyal iletimi ve bitki savunma tepkileri gibi çeşitli yönlerde önemli roller oynayan bitkiye özgü bir transkripsiyon faktörü türüdür27. İlk GRF geninin O. sativa'da tanımlanmasından bu yana28, birçok türde giderek daha fazla GRF geni tanımlanmış ve bitki büyümesi, gelişimi ve stres tepkisini etkilediği gösterilmiştir8, 29, 30, 31, 32. Brassica juncea genom dizisinin yayınlanmasıyla BjGRF gen ailesinin tanımlanması mümkün hale gelmiştir33. Bu çalışmada, hardal genomunun tamamında 34 BjGRF geni tanımlanmış ve kromozomal konumlarına göre BjGRF01–BjGRF34 olarak adlandırılmıştır. Bunların tümü, yüksek oranda korunmuş QLQ ve WRC alanları içermektedir. Fizikokimyasal özelliklerin analizi, BjGRF proteinlerinin (BjGRF28 hariç) amino asit sayılarındaki ve moleküler ağırlıklarındaki farklılıkların önemli olmadığını göstermiş ve bu da BjGRF aile üyelerinin benzer işlevlere sahip olabileceğini düşündürmüştür. Gen yapısı analizi, BjGRF genlerinin %64,7'sinin 4 ekzon içerdiğini gösterdi; bu da BjGRF gen yapısının evrimde nispeten korunduğunu gösteriyor, ancak BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ve BjGRF29 genlerindeki ekzon sayısı daha fazladır. Çalışmalar, ekzon veya intronların eklenmesi veya çıkarılmasının gen yapısında ve işlevinde farklılıklara yol açabileceğini ve böylece yeni genler oluşturabileceğini göstermiştir34,35,36. Bu nedenle, BjGRF'nin intronunun evrim sırasında kaybolduğunu ve bunun gen işlevinde değişikliklere neden olabileceğini tahmin ediyoruz. Mevcut çalışmalarla tutarlı olarak, intron sayısının gen ifadesiyle ilişkili olduğunu da bulduk. Bir gendeki intron sayısı fazla olduğunda, gen çeşitli olumsuz faktörlere hızlı bir şekilde yanıt verebilir.
Gen duplikasyonu, genomik ve genetik evrimde önemli bir faktördür37. İlgili çalışmalar, gen duplikasyonunun sadece GRF genlerinin sayısını artırmakla kalmayıp, aynı zamanda bitkilerin çeşitli olumsuz çevresel koşullara uyum sağlamasına yardımcı olacak yeni genler üretmenin bir yolu olarak da hizmet ettiğini göstermiştir38. Bu çalışmada toplam 48 duplike gen çifti bulunmuştur ve bunların tamamı segmental duplikasyonlardır; bu da segmental duplikasyonların bu ailedeki gen sayısını artırmanın ana mekanizması olduğunu göstermektedir. Literatürde, segmental duplikasyonun Arabidopsis ve çilekte GRF gen ailesi üyelerinin çoğalmasını etkili bir şekilde teşvik edebileceği ve bu gen ailesinin hiçbir türünde tandem duplikasyonuna rastlanmadığı bildirilmiştir27,39. Bu çalışmanın sonuçları, Arabidopsis thaliana ve çilek aileleri üzerine yapılan mevcut çalışmalarla tutarlıdır ve GRF ailesinin farklı bitkilerde segmental duplikasyon yoluyla gen sayısını artırabileceğini ve yeni genler üretebileceğini göstermektedir.
Bu çalışmada, hardalda toplam 34 BjGRF geni tanımlanmış ve bunlar 3 alt aileye ayrılmıştır. Bu genler benzer korunmuş motifler ve gen yapıları göstermiştir. Kolinearlık analizi, hardalda 48 çift segment duplikasyonunu ortaya çıkarmıştır. BjGRF promotör bölgesi, ışık tepkisi, hormonal tepki, çevresel stres tepkisi ve büyüme ve gelişme ile ilişkili cis-etkili elementler içermektedir. 34 BjGRF geninin ekspresyonu hardal fide aşamasında (kökler, gövdeler, yapraklar) tespit edilmiş ve 10 BjGRF geninin ekspresyon paterni kuraklık koşulları altında incelenmiştir. Kuraklık stresi altındaki BjGRF genlerinin ekspresyon paternlerinin benzer olduğu ve kuraklık zorlama düzenlemesinde benzer rol oynayabileceği bulunmuştur. BjGRF03 ve BjGRF32 genleri kuraklık stresinde pozitif düzenleyici roller oynayabilirken, BjGRF06 ve BjGRF23 genleri kuraklık stresinde miR396 hedef genleri olarak rol oynamaktadır. Genel olarak, çalışmamız Brassicaceae bitkilerinde BjGRF gen fonksiyonunun gelecekteki keşfi için biyolojik bir temel sağlamaktadır.
Bu deneyde kullanılan hardal tohumları, Guizhou Tarım Bilimleri Akademisi, Guizhou Yağlı Tohum Araştırma Enstitüsü tarafından temin edilmiştir. Tohumlar bütün halde seçilerek toprağa ekildi (substrat:toprak = 3:1) ve dört yapraklı aşamaya ulaştıktan sonra kökler, gövdeler ve yapraklar toplandı. Bitkilere kuraklığı simüle etmek için %20 PEG 6000 uygulandı ve yapraklar 0, 3, 6, 12 ve 24 saat sonra toplandı. Tüm bitki örnekleri hemen sıvı azot içinde donduruldu ve daha sonra bir sonraki test için -80°C'lik bir dondurucuda saklandı.
Bu çalışma sırasında elde edilen veya analiz edilen tüm veriler, yayınlanan makalede ve ek bilgi dosyalarında yer almaktadır.
Yayın tarihi: 22 Ocak 2025