Sentetik böcek ilaçlarının yaygın kullanımı, dirençli organizmaların ortaya çıkması, çevresel bozulma ve insan sağlığına zarar verme gibi birçok soruna yol açmıştır. Bu nedenle, yeni mikrobiyal çözümlere ihtiyaç duyulmaktadır.böcek ilaçlarıİnsan sağlığı ve çevre için güvenli olan biyosürfaktanlara acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen rhamnolipid biyosürfaktan, sivrisinek (Culex quinquefasciatus) ve termit (Odontotermes obesus) larvalarına karşı toksisitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, uygulamalar arasında doza bağlı bir ölüm oranı olduğunu göstermiştir. Termit ve sivrisinek larvalarına karşı biyosürfaktanlar için 48 saatteki LC50 (ölümcül konsantrasyonun %50'si) değeri, doğrusal olmayan bir regresyon eğrisi uydurma yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Sonuçlar, biyosürfaktanın larvisidal ve antitermite aktivitesinin 48 saatlik LC50 değerlerinin (%95 güven aralığı) sırasıyla 26,49 mg/L (aralık 25,40 ila 27,57) ve 33,43 mg/L (aralık 31,09 ila 35,68) olduğunu göstermiştir. Histopatolojik incelemeye göre, biyosürfaktanlarla yapılan tedavi, larvaların ve termitlerin organel dokularında ciddi hasara neden olmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen mikrobiyal biyosürfaktanın, Cx quinquefasciatus ve O. obesus kontrolü için mükemmel ve potansiyel olarak etkili bir araç olduğunu göstermektedir.
Tropikal ülkeler çok sayıda sivrisinek kaynaklı hastalığa maruz kalmaktadır¹. Sivrisinek kaynaklı hastalıkların önemi yaygındır. Her yıl 400.000'den fazla insan sıtmadan ölmekte ve bazı büyük şehirlerde dang humması, sarı humma, chikungunya ve Zika gibi ciddi hastalıkların salgınları yaşanmaktadır². Vektör kaynaklı hastalıklar, dünya genelindeki enfeksiyonların altıda birini oluşturmakta olup, en önemli vakalara sivrisinekler neden olmaktadır³⁻⁴. Culex, Anopheles ve Aedes, hastalık bulaştırmasıyla en sık ilişkilendirilen üç sivrisinek cinsidir⁵. Aedes aegypti sivrisineği tarafından bulaştırılan bir enfeksiyon olan dang hummasının yaygınlığı son on yılda artmış ve önemli bir halk sağlığı tehdidi oluşturmaktadır⁴⁻⁸. Dünya Sağlık Örgütü'ne (DSÖ) göre, dünya nüfusunun %40'ından fazlası dang humması riski altındadır ve 100'den fazla ülkede yılda 50-100 milyon yeni vaka meydana gelmektedir⁹⁻¹¹. Dengue ateşi, dünya çapında görülme sıklığının artmasıyla büyük bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir12,13,14. Yaygın olarak Afrika Anopheles sivrisineği olarak bilinen Anopheles gambiae, tropikal ve subtropikal bölgelerde insan sıtmasının en önemli vektörüdür15. Batı Nil virüsü, St. Louis ensefaliti, Japon ensefaliti ve atlar ile kuşların viral enfeksiyonları, genellikle ev sivrisineği olarak adlandırılan Culex sivrisinekleri tarafından bulaştırılır. Ayrıca, bakteriyel ve parazitik hastalıkların da taşıyıcısıdırlar16. Dünyada 3.000'den fazla termit türü vardır ve 150 milyon yıldan fazla bir süredir varlar17. Çoğu zararlı toprakta yaşar ve selüloz içeren odun ve odun ürünleriyle beslenir. Hint termiti Odontotermes obesus, önemli mahsullere ve plantasyon ağaçlarına ciddi zararlar veren önemli bir zararlıdır18. Tarım alanlarında, çeşitli aşamalardaki termit istilaları, çeşitli mahsullere, ağaç türlerine ve yapı malzemelerine muazzam ekonomik zararlar verebilir. Termitler insan sağlığı sorunlarına da neden olabilir19.
Günümüz ilaç ve tarım alanlarında mikroorganizmalar ve zararlılardan kaynaklanan direnç sorunu karmaşıktır20,21. Bu nedenle, her iki şirket de yeni, uygun maliyetli antimikrobiyaller ve güvenli biyopestisitler aramalıdır. Sentetik pestisitler artık mevcuttur ve enfeksiyon yapıcı oldukları ve hedef olmayan faydalı böcekleri uzaklaştırdıkları gösterilmiştir22. Son yıllarda, çeşitli endüstrilerdeki uygulamaları nedeniyle biyosürfaktanlar üzerine yapılan araştırmalar genişlemiştir. Biyosürfaktanlar tarım, toprak iyileştirme, petrol çıkarma, bakteri ve böcek uzaklaştırma ve gıda işleme alanlarında çok faydalı ve hayati öneme sahiptir23,24. Biyosürfaktanlar veya mikrobiyal sürfaktanlar, kıyı habitatlarında ve petrolle kirlenmiş alanlarda bakteri, maya ve mantar gibi mikroorganizmalar tarafından üretilen biyosürfaktan kimyasallarıdır25,26. Kimyasal olarak türetilmiş sürfaktanlar ve biyosürfaktanlar, doğrudan doğal ortamdan elde edilen iki tiptir27. Çeşitli biyosürfaktanlar deniz habitatlarından elde edilir28,29. Bu nedenle, bilim insanları doğal bakterilere dayalı biyosürfaktan üretimi için yeni teknolojiler aramaktadır30,31. Bu tür araştırmalardaki gelişmeler, bu biyolojik bileşiklerin çevre koruma açısından önemini göstermektedir32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium ve bu bakteri cinsleri iyi incelenmiş temsilcilerdir23,33.
Çok çeşitli uygulama alanlarına sahip birçok biyosürfaktan türü bulunmaktadır34. Bu bileşiklerin önemli bir avantajı, bazılarının antibakteriyel, larvisidal ve insektisit aktiviteye sahip olmasıdır. Bu, tarım, kimya, ilaç ve kozmetik endüstrilerinde kullanılabilecekleri anlamına gelir35,36,37,38. Biyosürfaktanlar genellikle biyolojik olarak parçalanabilir ve çevreye faydalı olduklarından, mahsulleri korumak için entegre zararlı yönetimi programlarında kullanılırlar39. Bu nedenle, Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen mikrobiyal biyosürfaktanların larvisidal ve termit karşıtı aktivitesi hakkında temel bilgiler edinilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda rhamnolipid biyosürfaktanlara maruz kaldıklarında ölüm oranlarını ve histolojik değişiklikleri inceledik. Ek olarak, mikroalgler, daphnia ve balıklar için akut toksisiteyi belirlemek amacıyla yaygın olarak kullanılan Kantitatif Yapı-Aktivite (QSAR) bilgisayar programı Ekolojik Yapı-Aktivite (ECOSAR) programını değerlendirdik.
Bu çalışmada, saflaştırılmış biyosürfaktanların 30 ila 50 mg/ml arasında (5 mg/ml aralıklarla) değişen çeşitli konsantrasyonlardaki termitlere karşı antitermite aktivitesi (toksisitesi) test edilmiştir. Testler, Hint termitleri O. obesus ve dördüncü tür C. solanacearum'a karşı yapılmıştır. Sivrisinek larvaları, doğrusal olmayan regresyon eğrisi uydurma yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır. Sonuçlar, termit ölüm oranının biyosürfaktan konsantrasyonu arttıkça arttığını göstermiştir. Sonuçlar, biyosürfaktanın larva öldürücü aktiviteye (Şekil 1) ve termitlere karşı aktiviteye (Şekil 2) sahip olduğunu ve 48 saatlik LC50 değerlerinin ( %95 CI) sırasıyla 26,49 mg/L (25,40 ila 27,57) ve 33,43 mg/L (Şekil 31,09 ila 35,68) olduğunu göstermiştir (Tablo 1). Akut toksisite (48 saat) açısından, biyosürfaktan test edilen organizmalar için "zararlı" olarak sınıflandırılmıştır. Bu çalışmada üretilen biyosürfaktan, maruz kalmanın 24-48 saati içinde %100 ölüm oranıyla mükemmel larva öldürücü aktivite göstermiştir.
Larvisidal aktivite için LC50 değerini hesaplayın. Göreceli ölüm oranı (%) için doğrusal olmayan regresyon eğrisi uydurması (düz çizgi) ve %95 güven aralığı (gölgeli alan).
Termitlere karşı etkinliğin LC50 değerini hesaplayın. Göreceli ölüm oranı (%) için doğrusal olmayan regresyon eğrisi uydurması (düz çizgi) ve %95 güven aralığı (gölgeli alan).
Deneyin sonunda, mikroskop altında morfolojik değişiklikler ve anormallikler gözlemlendi. Morfolojik değişiklikler, kontrol ve işlem görmüş gruplarda 40x büyütmede gözlemlendi. Şekil 3'te gösterildiği gibi, biyosürfaktanlarla işlem görmüş larvaların çoğunda büyüme bozukluğu meydana geldi. Şekil 3a normal bir Cx. quinquefasciatus'u, Şekil 3b ise anormal bir Cx. Causes beş nematod larvasını göstermektedir.
Biyosürfaktanların subletal (LC50) dozlarının Culex quinquefasciatus larvalarının gelişimi üzerindeki etkisi. 40× büyütmede normal bir Cx'in ışık mikroskobu görüntüsü (a). quinquefasciatus (b) Anormal Cx. Beş nematod larvasına neden olur.
Bu çalışmada, işlem görmüş larvaların (Şekil 4) ve termitlerin (Şekil 5) histolojik incelemesi, karın bölgesinde azalma ve kaslarda, epitel tabakalarında ve orta bağırsak derisinde hasar dahil olmak üzere çeşitli anormallikler ortaya koymuştur. Histoloji, bu çalışmada kullanılan biyosürfaktanın inhibitör aktivitesinin mekanizmasını ortaya koymuştur.
Normal, tedavi edilmemiş 4. evre Cx quinquefasciatus larvalarının (kontrol: (a,b)) ve biyosürfaktan ile tedavi edilmiş larvaların (tedavi: (c,d)) histopatolojisi. Oklar, tedavi edilmiş bağırsak epitelini (epi), çekirdekleri (n) ve kası (mu) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Normal, tedavi edilmemiş O. obesus'un (kontrol: (a,b)) ve biyosürfaktanla tedavi edilmiş olanın (tedavi: (c,d)) histopatolojisi. Oklar sırasıyla bağırsak epitelini (epi) ve kası (mu) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 50 µm.
Bu çalışmada, rhamnolipid biyosürfaktan ürünlerinin birincil üreticilere (yeşil algler), birincil tüketicilere (su pireleri) ve ikincil tüketicilere (balıklar) olan akut toksisitesini tahmin etmek için ECOSAR kullanılmıştır. Bu program, moleküler yapıya dayalı toksisiteyi değerlendirmek için gelişmiş nicel yapı-aktivite bileşik modelleri kullanır. Model, maddelerin sucul türlere olan akut ve uzun vadeli toksisitesini hesaplamak için yapı-aktivite (SAR) yazılımı kullanır. Özellikle, Tablo 2, çeşitli türler için tahmini ortalama öldürücü konsantrasyonları (LC50) ve ortalama etkili konsantrasyonları (EC50) özetlemektedir. Şüpheli toksisite, Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesine İlişkin Küresel Uyumlaştırılmış Sistem (GHS) kullanılarak dört seviyeye ayrılmıştır (Tablo 3).
Vektör kaynaklı hastalıkların, özellikle sivrisinek ve Aedes sivrisinek türlerinin kontrolü, Mısırlılar için şu anda zorlu bir iştir 40,41,42,43,44,45,46. Piretroidler ve organofosfatlar gibi bazı kimyasal olarak temin edilebilen pestisitler bir miktar faydalı olsa da, diyabet, üreme bozuklukları, nörolojik bozukluklar, kanser ve solunum yolu hastalıkları dahil olmak üzere insan sağlığı için önemli riskler oluşturmaktadır. Dahası, zamanla bu böcekler bunlara karşı direnç kazanabilir13,43,48. Bu nedenle, etkili ve çevre dostu biyolojik kontrol önlemleri, sivrisinek kontrolünde daha popüler bir yöntem haline gelecektir49,50. Benelli51, sivrisinek vektörlerinin erken kontrolünün kentsel alanlarda daha etkili olacağını öne sürmüş, ancak kırsal alanlarda larvisit kullanımını önermemiştir52. Tom ve ark.53 ayrıca, sivrisineklerin olgunlaşmamış aşamalarında kontrol edilmesinin güvenli ve basit bir strateji olacağını, çünkü kontrol ajanlarına daha duyarlı olduklarını öne sürmüştür54.
Güçlü bir suş (Enterobacter cloacae SJ2) tarafından biyosürfaktan üretimi, tutarlı ve umut verici bir etkinlik göstermiştir. Önceki çalışmamızda, Enterobacter cloacae SJ2'nin fizikokimyasal parametreler kullanarak biyosürfaktan üretimini optimize ettiğini bildirmiştik.26 Çalışmalarına göre, potansiyel bir E. cloacae izolatı tarafından biyosürfaktan üretimi için en uygun koşullar 36 saat inkübasyon, 150 rpm'de çalkalama, pH 7,5, 37 °C, 1 ppt tuzluluk, karbon kaynağı olarak %2 glikoz ve %1 maya idi. Ekstrakt, 2,61 g/L biyosürfaktan elde etmek için azot kaynağı olarak kullanıldı. Ek olarak, biyosürfaktanlar TLC, FTIR ve MALDI-TOF-MS kullanılarak karakterize edildi. Bu, ramnolipidin bir biyosürfaktan olduğunu doğruladı. Glikolipid biyosürfaktanlar, diğer biyosürfaktan türleri arasında en yoğun şekilde incelenen sınıftır.55 Bunlar, esas olarak yağ asidi zincirlerinden oluşan karbonhidrat ve lipit kısımlarından oluşur. Glikolipitler arasında başlıca temsilcileri ramnolipit ve soforolipittir56. Ramnolipitler, mono- veya di-β-hidroksidekanoik aside bağlı iki ramnoz parçası içerir57. Ramnolipitlerin tıp ve ilaç endüstrilerindeki kullanımı iyi bilinmektedir58, ayrıca son zamanlarda pestisit olarak da kullanılmaktadır59.
Biyosürfaktanın solunum sifonunun hidrofobik bölgesiyle etkileşimi, suyun stoma boşluğundan geçmesine izin vererek larvaların su ortamıyla temasını artırır. Biyosürfaktanların varlığı, uzunluğu yüzeye yakın olan trakeayı da etkiler; bu da larvaların yüzeye sürünmesini ve nefes almasını kolaylaştırır. Sonuç olarak, suyun yüzey gerilimi azalır. Larvalar su yüzeyine tutunamadıkları için tankın dibine düşerler, hidrostatik basıncı bozarlar, aşırı enerji harcamasına ve boğularak ölüme neden olurlar38,60. Benzer sonuçlar, Bacillus subtilis tarafından üretilen bir biyosürfaktanın Ephestia kuehniella'ya karşı larvisidal aktivite gösterdiği Ghribi61 tarafından da elde edilmiştir. Benzer şekilde, Cx. Das ve Mukherjee23'ün larvisidal aktivitesi de siklik lipopeptitlerin quinquefasciatus larvaları üzerindeki etkisini değerlendirmiştir.
Bu çalışmanın sonuçları, rhamnolipid biyosürfaktanların Cx. quinquefasciatus sivrisineklerine karşı larva öldürücü aktivitesiyle ilgilidir. Cx. quinquefasciatus sivrisineklerinin öldürülmesi, daha önce yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır. Örneğin, Bacillus cinsinin çeşitli bakterileri tarafından üretilen surfaktin bazlı biyosürfaktanlar kullanılmıştır. ve Pseudomonas spp. Bazı erken raporlar64,65,66, Bacillus subtilis'ten elde edilen lipopeptit biyosürfaktanların larva öldürücü aktivitesini bildirmiştir23. Deepali ve ark. 63, Stenotropomonas maltophilia'dan izole edilen rhamnolipid biyosürfaktanın 10 mg/L konsantrasyonda güçlü larva öldürücü aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur. Silva ve ark. 67, rhamnolipid biyosürfaktanın Ae. aegypti'ye karşı 1 g/L konsantrasyonda larva öldürücü aktivitesini bildirmiştir. Kanakdande ve ark. 68 numaralı çalışmada, Bacillus subtilis tarafından üretilen lipopeptit biyosürfaktanların, Okaliptüs'ün lipofilik fraksiyonu ile Culex larvalarında ve termitlerde genel ölüm oranına neden olduğu bildirilmiştir. Benzer şekilde, Masendra ve ark. 69 numaralı çalışmada, E. ham özütünün lipofilik n-heksan ve EtOAc fraksiyonlarında işçi karınca (Cryptotermes cynocephalus Light.) ölüm oranının %61,7 olduğu bildirilmiştir.
Parthipan ve ark. 70, sıtma paraziti Plasmodium'un vektörü olan Anopheles Stephensi'ye karşı Bacillus subtilis A1 ve Pseudomonas stutzeri NA3 tarafından üretilen lipopeptit biyosürfaktanların insektisit kullanımını rapor etmiştir. Farklı konsantrasyonlarda biyosürfaktanlarla muamele edildiğinde larvaların ve pupaların daha uzun süre hayatta kaldığını, daha kısa yumurtlama dönemlerine sahip olduğunu, steril olduğunu ve daha kısa yaşam sürelerine sahip olduğunu gözlemlemişlerdir. B. subtilis biyosürfaktan A1'in gözlemlenen LC50 değerleri, farklı larva evreleri (yani larva I, II, III, IV ve pupa evresi) için sırasıyla 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 ve 7,99 mg/L olmuştur. Buna karşılık, Pseudomonas stutzeri NA3'ün I-IV larva evreleri ve pupa evreleri için biyosürfaktan konsantrasyonları sırasıyla 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 ve 6,99 mg/L idi. Hayatta kalan larvaların ve pupaların gecikmiş fenolojisinin, insektisit uygulamalarının neden olduğu önemli fizyolojik ve metabolik bozulmaların sonucu olduğu düşünülmektedir71.
Wickerhamomyces anomalus suşu CCMA 0358, Aedes sivrisineklerine karşı %100 larva öldürücü aktiviteye sahip bir biyosürfaktan üretir. aegypti 24 saatlik aralıkta 38, Silva ve ark. tarafından bildirilen değerden daha yüksektir. Ayçiçek yağı karbon kaynağı olarak kullanılarak Pseudomonas aeruginosa'dan üretilen bir biyosürfaktanın 48 saat içinde larvaların %100'ünü öldürdüğü gösterilmiştir 67. Abinaya ve ark.72 ve Pradhan ve ark.73 ayrıca Bacillus cinsinin çeşitli izolatları tarafından üretilen sürfaktanların larva öldürücü veya insektisit etkilerini de göstermiştir. Senthil-Nathan ve ark. tarafından daha önce yayınlanan bir çalışmada, bitki lagünlerine maruz kalan sivrisinek larvalarının %100'ünün ölme olasılığının yüksek olduğu bulunmuştur. 74.
Böcek ilaçlarının böcek biyolojisi üzerindeki öldürücü olmayan etkilerinin değerlendirilmesi, entegre zararlı yönetimi programları için kritik öneme sahiptir çünkü öldürücü olmayan dozlar/konsantrasyonlar böcekleri öldürmez ancak biyolojik özellikleri bozarak gelecek nesillerdeki böcek popülasyonlarını azaltabilir.10 Siqueira ve ark. 75, Aedes aegypti suşlarının larva evresinde, 50 ila 300 mg/ml arasında değişen çeşitli konsantrasyonlarda test edildiğinde rhamnolipid biyosürfaktanının (300 mg/ml) tam larvisidal aktivite (ölüm oranı %100) gösterdiğini gözlemlemiştir. Ölüm süresi ve öldürücü olmayan konsantrasyonların larva hayatta kalma ve yüzme aktivitesi üzerindeki etkilerini analiz etmişlerdir. Ayrıca, biyosürfaktanın öldürücü olmayan konsantrasyonlarına (örneğin, 50 mg/mL ve 100 mg/mL) 24-48 saat maruz kaldıktan sonra yüzme hızında bir azalma gözlemlemişlerdir. Umut vadeden öldürücü olmayan rollere sahip zehirlerin, maruz kalan zararlılara çoklu hasar vermede daha etkili olduğu düşünülmektedir.76
Sonuçlarımızın histolojik gözlemleri, Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen biyosürfaktanların sivrisinek (Cx. quinquefasciatus) ve termit (O. obesus) larvalarının dokularını önemli ölçüde değiştirdiğini göstermektedir. Benzer anormallikler, An. gambiaes ve An. arabica'da fesleğen yağı preparatları tarafından da tanımlanmıştır (Ochola77). Kamaraj ve ark.78 ayrıca, altın nanopartiküllere maruz bırakılan An. Stephanie larvalarında aynı morfolojik anormallikleri tanımlamıştır. Vasantha-Srinivasan ve ark.79 ayrıca, çoban çantası esansiyel yağının Aedes albopictus'un odacık ve epitel tabakalarına ciddi şekilde zarar verdiğini bildirmiştir. Raghavendran ve ark., sivrisinek larvalarının yerel bir Penicillium mantarının 500 mg/ml misel ekstresi ile muamele edildiğini ve Aedes aegypti ve Cx. aegypti'de ciddi histolojik hasar gösterdiğini bildirmiştir. Ölüm oranı %80. Daha önce Abinaya ve ark. tarafından yapılan çalışmada, Aedes aegypti'nin dördüncü evre larvaları incelenmiş ve B. licheniformis ekzopolisakkaritleri ile muamele edilen Aedes aegypti'de mide kör kesesi, kas atrofisi, sinir kordonu ganglionlarının hasarı ve düzensizliği de dahil olmak üzere çok sayıda histolojik değişiklik bulunmuştur.72 Raghavendran ve ark.'na göre, P. daleae misel ekstresi ile muameleden sonra, test edilen sivrisineklerin (4. evre larvalar) orta bağırsak hücrelerinde bağırsak lümeninde şişme, hücreler arası içerikte azalma ve nükleer dejenerasyon gözlemlenmiştir.81 Aynı histolojik değişiklikler, ekinezya yaprağı ekstresi ile muamele edilen sivrisinek larvalarında da gözlemlenmiş ve bu da muamele edilen bileşiklerin insektisit potansiyelini göstermiştir.50
ECOSAR yazılımının kullanımı uluslararası alanda tanınmıştır82. Mevcut araştırmalar, ECOSAR biyosürfaktanlarının mikroalgler (C. vulgaris), balıklar ve su pireleri (D. magna) üzerindeki akut toksisitesinin Birleşmiş Milletler tarafından tanımlanan "toksisite" kategorisine girdiğini göstermektedir83. ECOSAR ekotoksikite modeli, maddelerin akut ve uzun vadeli toksisitesini tahmin etmek için SAR ve QSAR kullanır ve genellikle organik kirleticilerin toksisitesini tahmin etmek için kullanılır82,84.
Bu çalışmada kullanılan paraformaldehit, sodyum fosfat tamponu (pH 7,4) ve diğer tüm kimyasallar Hindistan'daki HiMedia Laboratories firmasından satın alınmıştır.
Biyosürfaktan üretimi, tek karbon kaynağı olarak %1 ham petrol ile desteklenmiş 200 mL steril Bushnell Haas ortamı içeren 500 mL Erlenmeyer şişelerinde gerçekleştirildi. Enterobacter cloacae SJ2'nin (1,4 × 10⁴ CFU/ml) ön kültürü aşılandı ve 37°C'de, 200 rpm'de 7 gün boyunca orbital çalkalayıcıda kültüre edildi. İnkübasyon süresinin ardından, biyosürfaktan, kültür ortamının 4°C'de 20 dakika boyunca 3400×g'de santrifüjlenmesiyle ekstrakte edildi ve elde edilen süpernatant tarama amacıyla kullanıldı. Biyosürfaktanların optimizasyon prosedürleri ve karakterizasyonu, önceki çalışmamızdan26 alınmıştır.
Culex quinquefasciatus larvaları, Tamil Nadu (Hindistan), Palanchipetai'deki İleri Deniz Biyolojisi Çalışmaları Merkezi'nden (CAS) temin edildi. Larvalar, 27 ± 2°C sıcaklıkta ve 12:12 (ışık:karanlık) fotoperiyodunda, deiyonize suyla dolu plastik kaplarda yetiştirildi. Sivrisinek larvalarına %10'luk glikoz çözeltisi verildi.
Culex quinquefasciatus larvaları açık ve korumasız septik tanklarda bulunmuştur. Laboratuvarda larvaları tanımlamak ve kültürlemek için standart sınıflandırma kılavuzlarını kullanın85. Larvisidal denemeler Dünya Sağlık Örgütü'nün önerilerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir86. SH. Quinquefasciatus'un dördüncü evre larvaları, kapasitelerinin üçte ikisi kadar hava boşluğu olan 25 ml ve 50 ml'lik gruplar halinde kapalı tüplere toplandı. Her tüpe ayrı ayrı biyosürfaktan (0–50 mg/ml) eklendi ve 25 °C'de saklandı. Kontrol tüpünde sadece damıtılmış su (50 ml) kullanıldı. Ölü larvalar, kuluçka süresi boyunca (12–48 saat) yüzme belirtisi göstermeyenler olarak kabul edildi87. Denklem kullanılarak larva ölüm yüzdesi hesaplandı. (1)88.
Odontotermitidae ailesi, Hindistan'daki Annamalai Üniversitesi Tarım Kampüsü'nde çürüyen kütüklerde bulunan Hint termiti Odontotermes obesus'u içerir. Bu biyosürfaktanın (0–50 mg/ml) zararlı olup olmadığını belirlemek için normal prosedürler kullanılarak test edildi. Her bir Whatman kağıdı şeridi, 30 dakika boyunca laminar hava akışında kurutulduktan sonra, 30, 40 veya 50 mg/ml konsantrasyonunda biyosürfaktan ile kaplandı. Önceden kaplanmış ve kaplanmamış kağıt şeritleri, bir Petri kabının ortasında test edildi ve karşılaştırıldı. Her Petri kabı yaklaşık otuz aktif termit O. obesus içerir. Kontrol ve test termitlerine besin kaynağı olarak ıslak kağıt verildi. Tüm plakalar kuluçka süresi boyunca oda sıcaklığında tutuldu. Termitler 12, 24, 36 ve 48 saat sonra öldü89,90. Daha sonra, farklı biyosürfaktan konsantrasyonlarında termit ölüm yüzdesini tahmin etmek için Denklem 1 kullanıldı. (2).
Örnekler buz üzerinde muhafaza edildi ve 100 ml 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,4) içeren mikrotüplere paketlenerek daha ileri analiz için Hindistan, Tamil Nadu, Mayiladuthurai Bölgesi, Sirkali'deki Rajiv Gandhi Su Ürünleri Merkezi (RGCA) Merkezi Su Ürünleri Patoloji Laboratuvarı'na (CAPL) gönderildi. Örnekler hemen 37°C'de 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitlendi.
Sabitleme aşamasından sonra, malzeme 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,4) ile üç kez yıkandı, kademeli olarak etanolde dehidrate edildi ve 7 gün boyunca LEICA reçinesine batırıldı. Daha sonra madde, reçine ve polimerleştirici ile doldurulmuş plastik bir kalıba yerleştirildi ve maddeyi içeren blok tamamen polimerize olana kadar 37°C'ye ısıtılmış bir fırına konuldu.
Polimerizasyondan sonra, bloklar LEICA RM2235 mikrotom (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, ABD) kullanılarak 3 mm kalınlığında kesildi. Kesitler, her slaytta altı kesit olacak şekilde slaytlara gruplandırıldı. Slaytlar oda sıcaklığında kurutuldu, ardından 7 dakika boyunca hematoksilin ile boyandı ve 4 dakika boyunca akan su ile yıkandı. Ek olarak, cilde 5 dakika boyunca eozin çözeltisi uygulandı ve 5 dakika boyunca akan su ile durulandı.
Akut toksisite, farklı tropikal seviyelerdeki su organizmaları kullanılarak tahmin edildi: 96 saatlik balık LC50, 48 saatlik D. magna LC50 ve 96 saatlik yeşil alg EC50. Rhamnolipid biyosürfaktanların balık ve yeşil alglere olan toksisitesi, ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından geliştirilen Windows için ECOSAR yazılımı sürüm 2.2 kullanılarak değerlendirildi. (Çevrimiçi olarak şu adreste mevcuttur: https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Larvisidal ve antitermite aktivitesine yönelik tüm testler üçer kez tekrarlandı. Larva ve termit ölüm verilerinin doğrusal olmayan regresyonu (doz yanıt değişkenlerinin logaritması) %95 güven aralığı ile ortanca öldürücü konsantrasyonu (LC50) hesaplamak için gerçekleştirildi ve konsantrasyon yanıt eğrileri Prism® (sürüm 8.0, GraphPad Software) Inc., ABD) 84, 91 kullanılarak oluşturuldu.
Bu çalışma, Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen mikrobiyal biyosürfaktanların sivrisinek larvalarına ve termitlere karşı öldürücü ajanlar olarak potansiyelini ortaya koymaktadır ve bu çalışma, larva öldürücü ve termit karşıtı etki mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Biyosürfaktanlarla muamele edilen larvaların histolojik incelemeleri, sindirim sisteminde, orta bağırsakta, beyin korteksinde hasar ve bağırsak epitel hücrelerinde hiperplazi olduğunu göstermiştir. Sonuçlar: Enterobacter cloacae SJ2 tarafından üretilen rhamnolipid biyosürfaktanın termit karşıtı ve larva öldürücü aktivitesinin toksikolojik değerlendirmesi, bu izolatın sivrisinek (Cx quinquefasciatus) ve termitlerin (O. obesus) vektör kaynaklı hastalıklarının kontrolü için potansiyel bir biyopestisit olduğunu ortaya koymuştur. Biyosürfaktanların çevresel toksisitesinin ve potansiyel çevresel etkilerinin anlaşılması gerekmektedir. Bu çalışma, biyosürfaktanların çevresel riskini değerlendirmek için bilimsel bir temel sağlamaktadır.
Yayın tarihi: 09.08.2024