Bu çalışma ticari ürünlerin öldürücülüğünü, öldürücü olmayan etkisini ve toksisitesini değerlendirdisipermetrinAnuran kurbağa yavrularına uygulanan formülasyonlar. Akut testte, 100–800 μg/L konsantrasyonları 96 saat boyunca test edildi. Kronik testte, doğal olarak oluşan sipermetrin konsantrasyonları (1, 3, 6 ve 20 μg/L) ölüm oranı için test edildi, ardından 7 gün boyunca mikronükleus testi ve kırmızı kan hücresi nükleer anormallikleri incelendi. Ticari sipermetrin formülasyonunun kurbağa yavrularına uygulanan LC50 değeri 273,41 μg L−1 idi. Kronik testte, en yüksek konsantrasyon (20 μg L−1), test edilen kurbağa yavrularının yarısını öldürdüğü için %50'den fazla ölüm oranına neden oldu. Mikronükleus testi 6 ve 20 μg L−1'de önemli sonuçlar gösterdi ve ticari sipermetrin formülasyonunun P. gracilis'e karşı genotoksik potansiyele sahip olduğunu gösteren birkaç nükleer anormallik tespit edildi. Sipermetrin, bu tür için yüksek risk taşımaktadır ve bu da çok sayıda soruna yol açabileceğini ve kısa ve uzun vadede ekosistemin dinamiklerini etkileyebileceğini göstermektedir. Dolayısıyla, ticari sipermetrin formülasyonlarının P. gracilis üzerinde toksik etkilere sahip olduğu sonucuna varılabilir.
Tarımsal faaliyetlerin sürekli genişlemesi ve yoğun bir şekilde uygulanması nedeniyle,haşere kontrolüÖnlemler nedeniyle su hayvanları sıklıkla pestisitlere maruz kalmaktadır1,2. Tarım alanlarının yakınındaki su kaynaklarının kirlenmesi, amfibiler gibi hedef dışı organizmaların gelişimini ve hayatta kalmasını etkileyebilir.
Amfibiler, çevresel matrislerin değerlendirilmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Anuranlar, karmaşık yaşam döngüleri, hızlı larva büyüme oranları, trofik durumları, geçirgen derileri10,11, üreme için suya bağımlılıkları12 ve korunmasız yumurtaları11,13,14 gibi benzersiz özellikleri nedeniyle çevre kirleticilerinin iyi biyoindikatörleri olarak kabul edilirler. Ağlayan kurbağa olarak bilinen küçük su kurbağasının (Physalaemus gracilis), pestisit kirliliğinin biyoindikatör bir türü olduğu gösterilmiştir4,5,6,7,15. Bu tür, Arjantin, Uruguay, Paraguay ve Brezilya'da durgun sularda, korunan alanlarda veya değişken habitatlı alanlarda bulunur1617 ve geniş dağılımı ve farklı habitatlara toleransı18 nedeniyle IUCN sınıflandırmasına göre stabil kabul edilir.
Sipermetrine maruz kalmanın ardından amfibilerde, yavru kurbağalarda davranışsal, morfolojik ve biyokimyasal değişiklikler23,24,25, değişen ölüm oranı ve metamorfoz süresi, enzimatik değişiklikler, azalmış yumurtadan çıkma başarısı24,25, hiperaktivite26, kolinesteraz aktivitesinin inhibisyonu27 ve yüzme performansında değişiklikler7,28 dahil olmak üzere subletal etkiler bildirilmiştir. Ancak, sipermetrin'in amfibilerde genotoksik etkilerine ilişkin çalışmalar sınırlıdır. Bu nedenle, anuran türlerinin sipermetrine duyarlılığını değerlendirmek önemlidir.
Çevre kirliliği, amfibilerin normal büyüme ve gelişimini etkiler, ancak en ciddi olumsuz etki, pestisit maruziyetinin neden olduğu DNA'daki genetik hasardır13. Kan hücresi morfolojisi analizi, kirliliğin ve bir maddenin yabani türler üzerindeki potansiyel toksisitesinin önemli bir biyoindikatörüdür29. Mikronükleus testi, kimyasalların çevredeki genotoksisitesini belirlemek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir30. Amfibiler gibi organizmaların kimyasal kirliliğinin iyi bir göstergesi olan hızlı, etkili ve ucuz bir yöntemdir31,32 ve genotoksik kirleticilere maruz kalma hakkında bilgi sağlayabilir33.
Bu çalışmanın amacı, mikronükleus testi ve ekolojik risk değerlendirmesi kullanarak ticari sipermetrin formülasyonlarının küçük su kurbağa yavruları için toksik potansiyelini değerlendirmektir.
Testin akut döneminde farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin'e maruz bırakılan P. gracilis kurbağa yavrularının kümülatif ölüm oranı (%).
Kronik bir test sırasında farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin'e maruz bırakılan P. gracilis kurbağa yavrularının kümülatif ölüm oranı (%).
Gözlemlenen yüksek ölüm oranı, farklı sipermetrin konsantrasyonlarına (6 ve 20 μg/L) maruz kalan amfibilerde genotoksik etkilerin bir sonucuydu; bu durum eritrositlerdeki mikronükleus (MN) ve nükleer anormalliklerin varlığıyla kanıtlanmıştır. MN oluşumu mitozdaki hataları gösterir ve kromozomların mikrotübüllere zayıf bağlanması, kromozom alımı ve taşınmasından sorumlu protein komplekslerindeki kusurlar, kromozom ayrışmasındaki hatalar ve DNA hasarı onarımındaki hatalarla ilişkilidir38,39 ve pestisit kaynaklı oksidatif stresle ilişkili olabilir40,41. Değerlendirilen tüm konsantrasyonlarda başka anormallikler de gözlendi. Artan sipermetrin konsantrasyonları, eritrositlerdeki nükleer anormallikleri sırasıyla en düşük (1 μg/L) ve en yüksek (20 μg/L) dozlarda %5 ve %20 oranında artırdı. Örneğin, bir türün DNA'sındaki değişiklikler hem kısa hem de uzun vadeli hayatta kalma üzerinde ciddi sonuçlara yol açabilir ve popülasyon azalmasına, üreme uygunluğunun değişmesine, akraba evliliğine, genetik çeşitliliğin kaybına ve göç hızlarının değişmesine neden olabilir. Tüm bu faktörler türlerin hayatta kalmasını ve devamlılığını etkileyebilir42,43. Eritroid anormalliklerin oluşumu sitokinezde bir tıkanıklığa işaret edebilir ve bu da anormal hücre bölünmesine (çift çekirdekli eritrositler) neden olabilir44,45; çok loblu çekirdekler, çok sayıda loba sahip nükleer membran çıkıntılarıdır46, nükleer böbrekler/kabarcıklar gibi diğer eritroid anormallikler ise DNA amplifikasyonu ile ilişkili olabilir47. Çekirdeksiz eritrositlerin varlığı, özellikle kirli suda bozulmuş oksijen taşınımına işaret edebilir48,49. Apoptoz hücre ölümünü gösterir50.
Diğer çalışmalar da sipermetrinin genotoksik etkilerini göstermiştir. Kabaña ve ark.51, Odontophrynus americanus hücrelerinde 96 saat boyunca yüksek konsantrasyonlarda (5000 ve 10.000 μg L−1) sipermetrin maruziyetinden sonra mikronükleus ve nükleer değişimlerin (binükleer hücreler ve apoptotik hücreler gibi) varlığını göstermiştir. Sipermetrin kaynaklı apoptozis ayrıca P. biligonigerus52 ve Rhinella arenarum53'ta da tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, sipermetrinin çeşitli su organizmaları üzerinde genotoksik etkilere sahip olduğunu ve MN ve ENA testinin amfibiler üzerindeki subletal etkilerin bir göstergesi olabileceğini ve toksik maddelere maruz kalan yerli türler ve yabani popülasyonlar için geçerli olabileceğini düşündürmektedir12.
Sipermetrin'in ticari formülasyonları, ABD Çevre Koruma Ajansı'nın (EPA) seviyesini aşan HQ'lar ile yüksek bir çevresel tehlike (hem akut hem de kronik) oluşturur;54 ve bu da çevrede mevcut olması durumunda türü olumsuz etkileyebilir. Kronik risk değerlendirmesinde, ölüm oranı için NOEC 3 μg L−1 olarak bulundu ve bu da suda bulunan konsantrasyonların tür için risk oluşturabileceğini doğruladı55. Endosülfan ve sipermetrin karışımına maruz kalan R. arenarum larvaları için öldürücü NOEC, 168 saat sonra 500 μg L−1 idi; bu değer 336 saat sonra 0,0005 μg L−1'e düştü. Yazarlar, maruziyet süresi ne kadar uzunsa, türler için zararlı olan konsantrasyonların o kadar düşük olduğunu göstermektedir. Ayrıca, NOEC değerlerinin aynı maruziyet süresinde P. gracilis'inkinden daha yüksek olduğunu ve bunun da türlerin sipermetrine verdiği tepkinin türe özgü olduğunu vurgulamak önemlidir. Ayrıca, ölüm oranı açısından, P. gracilis'in sipermetrin maruziyetinden sonraki CHQ değeri 64,67'ye ulaşmış olup, bu değer ABD Çevre Koruma Ajansı'nın54 belirlediği referans değerinden yüksektir ve R. arenarum larvalarının CHQ değeri de bu değerden daha yüksektir (336 saat sonra CHQ > 388,00), bu da çalışılan insektisitlerin birçok amfibi türü için yüksek risk oluşturduğunu göstermektedir. P. gracilis'in metamorfozunu tamamlamak için yaklaşık 30 güne ihtiyaç duyduğu düşünüldüğünde56, çalışılan sipermetrin konsantrasyonlarının, enfekte bireylerin erken yaşta yetişkin veya üreme aşamasına girmesini önleyerek popülasyon azalmasına katkıda bulunabileceği sonucuna varılabilir.
Mikronükleus ve diğer eritrosit nükleer anormalliklerinin hesaplanan risk değerlendirmesinde, CHQ değerleri 14,92 ile 97,00 arasında değişmiş olup, bu da sipermetrinin doğal ortamında bile P. gracilis için potansiyel bir genotoksik risk taşıdığını göstermektedir. Ölüm oranı da hesaba katıldığında, P. gracilis tarafından tolere edilebilen ksenobiyotik bileşiklerin maksimum konsantrasyonu 4,24 μg L−1 olmuştur. Ancak, 1 μg/L kadar düşük konsantrasyonlar bile genotoksik etkiler göstermiştir. Bu durum, anormal bireylerin sayısında artışa57 yol açabilir ve türlerin yaşam alanlarındaki gelişim ve üremelerini etkileyerek amfibi popülasyonlarında azalmaya neden olabilir.
Böcek ilacı sipermetrininin ticari formülasyonları P. gracilis'e karşı yüksek akut ve kronik toksisite göstermiştir. Mikronükleus ve eritrosit nükleer anormalliklerinin, özellikle tırtıklı çekirdekler, loblu çekirdekler ve veziküler çekirdeklerin varlığıyla kanıtlandığı üzere, muhtemelen toksik etkilere bağlı olarak daha yüksek ölüm oranları gözlenmiştir. Ayrıca, incelenen türler hem akut hem de kronik olarak artan çevresel riskler göstermiştir. Bu veriler, araştırma grubumuz tarafından yapılan önceki çalışmalarla birleştirildiğinde, farklı ticari sipermetrin formülasyonlarının bile P. gracilis'te asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) aktivitelerinde ve oksidatif streste azalmaya neden olduğunu58 ve yüzme aktivitesinde değişikliklere ve ağız malformasyonlarına59 yol açtığını göstererek, ticari sipermetrin formülasyonlarının bu türe karşı yüksek öldürücü ve öldürücü olmayan toksisiteye sahip olduğunu göstermektedir. Hartmann ve ark. 60, sipermetrin'in ticari formülasyonlarının, dokuz farklı pestisit ile karşılaştırıldığında P. gracilis ve aynı cinsin başka bir türü (P. cuvieri) için en toksik olduğunu tespit etmiştir. Bu, çevre koruma amacıyla yasal olarak onaylanmış sipermetrin konsantrasyonlarının yüksek ölüm oranına ve uzun vadeli nüfus azalmasına yol açabileceğini göstermektedir.
Çevrede bulunan konsantrasyonlar yüksek ölüm oranlarına yol açabileceği ve P. gracilis için potansiyel bir risk oluşturabileceği için, pestisitin amfibiler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Özellikle Brezilya türleri olmak üzere, bu organizmalar hakkındaki veriler sınırlı olduğundan, amfibi türleri üzerinde araştırmalar teşvik edilmelidir.
Kronik toksisite testi statik koşullar altında 168 saat (7 gün) sürdü ve öldürücü olmayan konsantrasyonlar şunlardı: 1, 3, 6 ve 20 μg ai L−1. Her iki deneyde de, tedavi grubu başına 10 kurbağa yavrusu altı tekrarla değerlendirildi ve konsantrasyon başına toplam 60 kurbağa yavrusu elde edildi. Bu arada, sadece su içeren tedavi negatif kontrol görevi gördü. Her deney düzeneği, 500 ml kapasiteli ve 50 ml çözelti başına 1 kurbağa yavrusu yoğunluğunda steril bir cam kaptan oluşuyordu. Buharlaşmayı önlemek için şişe polietilen filmle kapatıldı ve sürekli havalandırıldı.
Su, 0, 96 ve 168. saatlerde pestisit konsantrasyonlarını belirlemek için kimyasal olarak analiz edildi. Sabin ve ark. 68 ile Martins ve ark. 69'a göre, analizler Santa Maria Federal Üniversitesi Pestisit Analiz Laboratuvarı'nda (LARP), üçlü dört kutuplu kütle spektrometrisine bağlı gaz kromatografisi (Varian model 1200, Palo Alto, Kaliforniya, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Sudaki pestisitlerin kantitatif tayini ek materyal olarak gösterilmiştir (Tablo SM1).
Mikronükleus testi (MNT) ve kırmızı hücre nükleer anormallik testi (RNA) için, her tedavi grubundan 15 kurbağa yavrusu analiz edildi. Kurbağa yavruları %5 lidokain (50 mg g-170) ile anestezi altına alındı ve tek kullanımlık heparinli şırıngalar kullanılarak kalp delinmesi yoluyla kan örnekleri alındı. Steril mikroskop lamları üzerinde kan yaymaları hazırlandı, havada kurutuldu, %100 metanol (4 °C) ile 2 dakika fiksasyon yapıldı ve ardından karanlıkta 15 dakika %10'luk Giemsa solüsyonu ile boyandı. İşlemin sonunda, fazla boyayı uzaklaştırmak için lamlar distile su ile yıkandı ve oda sıcaklığında kurutuldu.
Her kurbağa yavrusundan en az 1000 alyuvar, MN ve ENA'nın varlığını belirlemek için 71 objektifli 100x mikroskop kullanılarak analiz edildi. Kurbağa yavrularından toplam 75.796 alyuvar, sipermetrin konsantrasyonları ve kontroller dikkate alınarak değerlendirildi. Genotoksisite, aşağıdaki nükleer lezyonların sıklığını belirleyerek Carrasco ve ark. ve Fenech ve ark.38,72 yöntemine göre analiz edildi: (1) anükleat hücreler: çekirdeği olmayan hücreler; (2) apoptotik hücreler: nükleer parçalanma, programlanmış hücre ölümü; (3) binükleat hücreler: iki çekirdeği olan hücreler; (4) nükleer tomurcuklar veya bleb hücreleri: nükleer membranın küçük çıkıntılarına sahip çekirdekli hücreler, mikronükleuslara benzer boyutta blebler; (5) karyolize hücreler: iç materyali olmayan sadece çekirdeğin ana hatlarına sahip hücreler; (6) çentikli hücreler: şekillerinde belirgin çatlaklar veya çentikler bulunan, böbrek şeklindeki çekirdekler olarak da adlandırılan hücreler; (7) lobüllü hücreler: yukarıda belirtilen veziküllerden daha büyük nükleer çıkıntılara sahip hücreler; ve (8) mikro hücreler: yoğunlaştırılmış çekirdeklere ve azalmış sitoplazmaya sahip hücreler. Değişiklikler, negatif kontrol sonuçlarıyla karşılaştırıldı.
Akut toksisite test sonuçları (LC50), GBasic yazılımı ve TSK-Trimmed Spearman-Karber yöntemi74 kullanılarak analiz edildi. Kronik test verileri, hata normalliği (Shapiro-Wilks) ve varyans homojenliği (Bartlett) açısından ön teste tabi tutuldu. Sonuçlar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. Verileri kendi aralarında karşılaştırmak için Tukey testi, tedavi grubu ile negatif kontrol grubu arasındaki verileri karşılaştırmak için ise Dunnett testi kullanıldı.
LOEC ve NOEC verileri Dunnett testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel testler %95 anlamlılık düzeyiyle (p < 0,05) Statistica 8.0 yazılımı (StatSoft) kullanılarak gerçekleştirildi.
Gönderi zamanı: 13 Mart 2025