Bu çalışma, ticari olarak satılan ilaçların öldürücülük, öldürücülük altı etki ve toksisitesini değerlendirdi.sipermetrinKurbağa larvalarına yönelik formülasyonlar incelenmiştir. Akut testte, 96 saat boyunca 100–800 μg/L konsantrasyonları test edilmiştir. Kronik testte ise, doğal olarak oluşan sipermetrin konsantrasyonları (1, 3, 6 ve 20 μg/L) ölüm oranı açısından test edilmiş, ardından 7 gün boyunca mikronükleus testi ve kırmızı kan hücresi nükleer anormallikleri incelenmiştir. Ticari sipermetrin formülasyonunun kurbağa larvaları için LC50 değeri 273,41 μg L−1 olarak bulunmuştur. Kronik testte, en yüksek konsantrasyon (20 μg L−1), test edilen kurbağa larvalarının yarısını öldürdüğü için %50'den fazla ölüm oranına neden olmuştur. Mikronükleus testi, 6 ve 20 μg L−1 konsantrasyonlarında anlamlı sonuçlar göstermiş ve çeşitli nükleer anormallikler tespit edilmiştir; bu da ticari sipermetrin formülasyonunun P. gracilis'e karşı genotoksik potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Sipermetrin bu tür için yüksek risk oluşturmaktadır ve bu da kısa ve uzun vadede ekosistemin dinamiklerini etkileyebilecek ve birden fazla probleme yol açabilecek bir madde olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, ticari sipermetrin formülasyonlarının P. gracilis üzerinde toksik etkileri olduğu sonucuna varılabilir.
Tarım faaliyetlerinin sürekli genişlemesi ve yoğun uygulaması nedeniylehaşere kontrolüAlınan önlemlere rağmen, su hayvanları sıklıkla pestisitlere maruz kalmaktadır1,2. Tarım alanlarının yakınındaki su kaynaklarının kirlenmesi, amfibiler gibi hedef olmayan organizmaların gelişimini ve hayatta kalmasını etkileyebilir.
Amfibiler, çevresel matrislerin değerlendirilmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Kurbağalar, karmaşık yaşam döngüleri, hızlı larva büyüme oranları, trofik durumları, geçirgen derileri10,11, üreme için suya bağımlılıkları12 ve korumasız yumurtaları11,13,14 gibi benzersiz özellikleri nedeniyle çevresel kirleticilerin iyi biyolojik göstergeleri olarak kabul edilir. Yaygın olarak ağlayan kurbağa olarak bilinen küçük su kurbağası (Physalaemus gracilis), pestisit kirliliğinin biyolojik gösterge türü olduğu gösterilmiştir4,5,6,7,15. Tür, Arjantin, Uruguay, Paraguay ve Brezilya'da durgun sularda, koruma alanlarında veya değişken habitatlı alanlarda bulunur1617 ve geniş dağılımı ve farklı habitatlara toleransı nedeniyle IUCN sınıflandırması tarafından kararlı olarak kabul edilir18.
Sipermetrin maruziyeti sonrasında amfibilerde ölümcül olmayan etkiler bildirilmiştir; bunlar arasında kurbağa larvalarında davranışsal, morfolojik ve biyokimyasal değişiklikler23,24,25, ölüm oranında ve metamorfoz süresinde değişiklikler, enzimatik değişiklikler, yumurtadan çıkma başarısında azalma24,25, hiperaktivite26, kolinesteraz aktivitesinin inhibisyonu27 ve yüzme performansında değişiklikler7,28 yer almaktadır. Bununla birlikte, amfibilerde sipermetrinin genotoksik etkilerine ilişkin çalışmalar sınırlıdır. Bu nedenle, kurbağa türlerinin sipermetrine karşı duyarlılığının değerlendirilmesi önemlidir.
Çevresel kirlilik, amfibilerin normal büyüme ve gelişimini etkiler, ancak en ciddi olumsuz etki, pestisit maruziyetinin neden olduğu DNA'daki genetik hasardır13. Kan hücresi morfolojisi analizi, kirliliğin ve bir maddenin vahşi türler üzerindeki potansiyel toksisitesinin önemli bir biyolojik göstergesidir29. Mikronükleus testi, çevredeki kimyasalların genotoksisitesini belirlemek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir30. Hızlı, etkili ve ucuz bir yöntem olup, amfibiler gibi organizmaların kimyasal kirliliğinin iyi bir göstergesidir31,32 ve genotoksik kirleticilere maruz kalma hakkında bilgi sağlayabilir33.
Bu çalışmanın amacı, mikronükleus testi ve ekolojik risk değerlendirmesi kullanarak ticari sipermetrin formülasyonlarının küçük sucul kurbağa larvaları üzerindeki toksik potansiyelini değerlendirmektir.
Testin akut döneminde farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin'e maruz bırakılan P. gracilis larvalarının kümülatif ölüm oranı (%).
Kronik bir test sırasında farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin maruz bırakılan P. gracilis larvalarının kümülatif ölüm oranı (%).
Gözlemlenen yüksek ölüm oranı, eritrositlerde mikronükleus (MN) ve nükleer anormalliklerin varlığıyla kanıtlandığı üzere, farklı konsantrasyonlarda (6 ve 20 μg/L) sipermetrin maruziyetine bağlı genotoksik etkilerden kaynaklanmıştır. MN oluşumu, mitozda hataları gösterir ve kromozomların mikrotübüllere zayıf bağlanması, kromozom alımı ve taşınmasından sorumlu protein komplekslerindeki kusurlar, kromozom ayrışmasındaki hatalar ve DNA hasar onarımındaki hatalarla ilişkilidir38,39 ve pestisit kaynaklı oksidatif stresle ilişkili olabilir40,41. Değerlendirilen tüm konsantrasyonlarda başka anormallikler de gözlemlenmiştir. Sipermetrin konsantrasyonlarının artması, eritrositlerdeki nükleer anormallikleri en düşük (1 μg/L) ve en yüksek (20 μg/L) dozlarda sırasıyla %5 ve %20 oranında artırmıştır. Örneğin, bir türün DNA'sındaki değişiklikler, hem kısa hem de uzun vadeli hayatta kalma açısından ciddi sonuçlar doğurabilir; bu da popülasyon azalmasına, üreme yeteneğinin değişmesine, akraba evliliğine, genetik çeşitliliğin kaybına ve göç oranlarının değişmesine yol açabilir. Tüm bu faktörler türlerin hayatta kalmasını ve devamlılığını etkileyebilir42,43. Eritroid anormalliklerinin oluşumu, sitokinezde bir tıkanıklığı gösterebilir ve anormal hücre bölünmesine (çift çekirdekli eritrositler) neden olabilir44,45; çok loblu çekirdekler, birden fazla loblu çekirdek zarının çıkıntılarıdır46, diğer eritroid anormallikleri ise nükleer böbrekler/kabarcıklar gibi DNA amplifikasyonu ile ilişkili olabilir47. Çekirdeksiz eritrositlerin varlığı, özellikle kirlenmiş suda oksijen taşınmasının bozulduğunu gösterebilir48,49. Apoptos hücre ölümünü gösterir50.
Diğer çalışmalar da sipermetrinin genotoksik etkilerini göstermiştir. Kabaña ve ark.51, 96 saat boyunca yüksek konsantrasyonlarda sipermetrine (5000 ve 10.000 μg L−1) maruz kaldıktan sonra Odontophrynus americanus hücrelerinde mikronükleus ve binükleer hücreler ve apoptotik hücreler gibi nükleer değişikliklerin varlığını göstermiştir. Sipermetrin kaynaklı apoptoz, P. biligonigerus52 ve Rhinella arenarum53'te de tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, sipermetrinin çeşitli su organizmaları üzerinde genotoksik etkileri olduğunu ve MN ve ENA testinin amfibiler üzerindeki subletal etkilerin bir göstergesi olabileceğini ve toksik maddelere maruz kalan yerli türler ve vahşi popülasyonlar için uygulanabilir olabileceğini düşündürmektedir12.
Sipermetrin içeren ticari formülasyonlar, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) seviyesini aşan HQ değerleriyle (hem akut hem de kronik) yüksek bir çevresel tehlike oluşturmaktadır ve çevrede bulunmaları halinde türleri olumsuz etkileyebilir. Kronik risk değerlendirmesinde, ölüm için NOEC değeri 3 μg L−1 olarak belirlenmiş olup, suda bulunan konsantrasyonların türler için risk oluşturabileceğini doğrulamaktadır. Endosülfan ve sipermetrin karışımına maruz kalan R. arenarum larvaları için ölümcül NOEC değeri 168 saat sonra 500 μg L−1 iken, bu değer 336 saat sonra 0,0005 μg L−1'e düşmüştür. Yazarlar, maruz kalma süresi uzadıkça türler için zararlı konsantrasyonların azaldığını göstermektedir. Ayrıca, NOEC değerlerinin aynı maruz kalma süresinde P. gracilis'inkinden daha yüksek olması, türün sipermetrine verdiği tepkinin türe özgü olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ölüm oranı açısından, sipermetrin maruziyetinden sonra P. gracilis'in CHQ değeri 64,67'ye ulaşmıştır ki bu, ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından belirlenen referans değerinden54 daha yüksektir ve R. arenarum larvalarının CHQ değeri de bu değerden daha yüksektir (336 saat sonra CHQ > 388,00), bu da incelenen insektisitlerin çeşitli amfibi türleri için yüksek risk oluşturduğunu göstermektedir. P. gracilis'in metamorfozunu tamamlaması yaklaşık 30 gün sürdüğü göz önüne alındığında56, incelenen sipermetrin konsantrasyonlarının, enfekte bireylerin erken yaşta yetişkin veya üreme evresine girmesini engelleyerek popülasyon azalmasına katkıda bulunabileceği sonucuna varılabilir.
Mikronükleus ve diğer eritrosit nükleer anormalliklerinin hesaplanan risk değerlendirmesinde, CHQ değerleri 14,92 ile 97,00 arasında değişmekte olup, bu da sipermetrinin doğal yaşam alanında bile P. gracilis için potansiyel bir genotoksik risk taşıdığını göstermektedir. Ölüm oranını dikkate alarak, P. gracilis için tolere edilebilir ksenobiyotik bileşiklerin maksimum konsantrasyonu 4,24 μg L−1 olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, 1 μg/L kadar düşük konsantrasyonlar da genotoksik etkiler göstermiştir. Bu durum, anormal bireylerin sayısında artışa57 yol açabilir ve türlerin yaşam alanlarındaki gelişimini ve üremesini etkileyerek amfibi popülasyonlarında azalmaya neden olabilir.
Sipermetrin böcek ilacının ticari formülasyonları, P. gracilis'e karşı yüksek akut ve kronik toksisite göstermiştir. Mikronükleus ve eritrosit nükleer anormalliklerinin, özellikle tırtıklı çekirdekler, loblu çekirdekler ve veziküler çekirdeklerin varlığıyla kanıtlandığı gibi, muhtemelen toksik etkilerden kaynaklanan daha yüksek ölüm oranları gözlemlenmiştir. Ek olarak, incelenen tür, hem akut hem de kronik olarak artan çevresel riskler göstermiştir. Bu veriler, araştırma grubumuzun önceki çalışmalarıyla birlikte, sipermetrinin farklı ticari formülasyonlarının bile P. gracilis'te asetilkolinesteraz (AChE) ve butirilkolinesteraz (BChE) aktivitelerinde ve oksidatif streste azalmaya neden olduğunu58 ve yüzme aktivitesinde değişikliklere ve oral malformasyonlara59 yol açtığını göstermiştir; bu da sipermetrinin ticari formülasyonlarının bu türe karşı yüksek ölümcül ve ölümcül olmayan toksisiteye sahip olduğunu göstermektedir. Hartmann vd. 60 numaralı çalışma, sipermetrinin ticari formülasyonlarının, diğer dokuz pestisitle karşılaştırıldığında P. gracilis ve aynı cinsin başka bir türü (P. cuvieri) için en toksik olduğunu bulmuştur. Bu, çevresel koruma için yasal olarak onaylanmış sipermetrin konsantrasyonlarının yüksek ölüm oranlarına ve uzun vadeli popülasyon azalmasına yol açabileceğini göstermektedir.
Pestisitin amfibiler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır, çünkü çevrede bulunan konsantrasyonlar yüksek ölüm oranlarına neden olabilir ve P. gracilis için potansiyel bir risk oluşturabilir. Özellikle Brezilya türleri olmak üzere, bu organizmalar hakkındaki veriler az olduğundan, amfibi türleri üzerinde yapılan araştırmalar teşvik edilmelidir.
Kronik toksisite testi, statik koşullar altında 168 saat (7 gün) sürdü ve subletal konsantrasyonlar 1, 3, 6 ve 20 μg aktif madde L−1 idi. Her iki deneyde de, her tedavi grubunda 10 kurbağa yavrusu değerlendirildi ve altı tekrar yapıldı; toplamda her konsantrasyon için 60 kurbağa yavrusu kullanıldı. Bu arada, sadece su içeren tedavi negatif kontrol olarak kullanıldı. Her deney düzeneği, 500 ml kapasiteli steril bir cam kap ve 50 ml çözelti başına 1 kurbağa yavrusu yoğunluğundan oluşuyordu. Şişe, buharlaşmayı önlemek için polietilen filmle kapatıldı ve sürekli olarak havalandırıldı.
Su, 0, 96 ve 168 saatte pestisit konsantrasyonlarını belirlemek için kimyasal olarak analiz edildi. Sabin vd. 68 ve Martins vd. 69'a göre, analizler Santa Maria Federal Üniversitesi Pestisit Analiz Laboratuvarı'nda (LARP) üçlü dörtlü kütle spektrometresi (Varian model 1200, Palo Alto, Kaliforniya, ABD) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi kullanılarak gerçekleştirildi. Sudaki pestisitlerin kantitatif tayini ek materyalde (Tablo SM1) gösterilmiştir.
Mikronükleus testi (MNT) ve kırmızı kan hücresi nükleer anormallik testi (RNA) için, her tedavi grubundan 15 kurbağa yavrusu analiz edildi. Kurbağa yavruları %5 lidokain (50 mg g-170) ile anestezi altına alındı ve tek kullanımlık heparinli şırıngalar kullanılarak kalp ponksiyonu yoluyla kan örnekleri alındı. Kan yaymaları steril mikroskop lamlarına hazırlandı, havada kurutuldu, 2 dakika boyunca %100 metanol (4 °C) ile sabitlendi ve ardından karanlıkta 15 dakika boyunca %10 Giemsa çözeltisi ile boyandı. İşlemin sonunda, fazla boyayı uzaklaştırmak için lamlar damıtılmış su ile yıkandı ve oda sıcaklığında kurutuldu.
Her bir kurbağa larvasından en az 1000 kırmızı kan hücresi, MN ve ENA varlığını belirlemek için 71 objektifli 100× mikroskop kullanılarak analiz edildi. Sipermetrin konsantrasyonları ve kontroller dikkate alınarak kurbağa larvalarından toplam 75.796 kırmızı kan hücresi değerlendirildi. Genotoksisite, Carrasco ve ark. ile Fenech ve ark.38,72'nin yöntemine göre aşağıdaki nükleer lezyonların sıklığının belirlenmesiyle analiz edildi: (1) çekirdeksiz hücreler: çekirdeği olmayan hücreler; (2) apoptotik hücreler: nükleer parçalanma, programlanmış hücre ölümü; (3) çift çekirdekli hücreler: iki çekirdekli hücreler; (4) nükleer tomurcuk veya kabarcık hücreleri: çekirdek zarının küçük çıkıntıları olan çekirdekli hücreler, mikronükleuslara benzer büyüklükte kabarcıklar; (5) karyolize hücreler: iç materyali olmayan, sadece çekirdeğin dış hatlarını gösteren hücreler; (6) Çentikli hücreler: Şekillerinde belirgin çatlaklar veya çentikler bulunan çekirdeklere sahip hücreler, böbrek şekilli çekirdekler olarak da adlandırılır; (7) Loblu hücreler: Yukarıda bahsedilen veziküllerden daha büyük çekirdek çıkıntılarına sahip hücreler; ve (8) Mikro hücreler: Yoğunlaşmış çekirdeklere ve azalmış sitoplazmaya sahip hücreler. Değişiklikler negatif kontrol sonuçlarıyla karşılaştırıldı.
Akut toksisite testi sonuçları (LC50), GBasic yazılımı ve TSK-Trimmed Spearman-Karber yöntemi74 kullanılarak analiz edildi. Kronik test verileri, hata normalliği (Shapiro-Wilks) ve varyans homojenliği (Bartlett) açısından ön testten geçirildi. Sonuçlar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. Verilerin kendi aralarında karşılaştırılması için Tukey testi, tedavi grubu ile negatif kontrol grubu arasındaki verilerin karşılaştırılması için ise Dunnett testi kullanıldı.
LOEC ve NOEC verileri Dunnett testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel testler, %95 anlamlılık düzeyinde (p < 0,05) Statistica 8.0 yazılımı (StatSoft) kullanılarak gerçekleştirildi.
Yayın tarihi: 13 Mart 2025