Bu çalışma ticari ürünlerin öldürücülüğünü, öldürücü olmayan etkisini ve toksisitesini değerlendirdisipermetrinformülasyonları anuran kurbağa yavrularına uygulandı. Akut testte, 100–800 μg/L konsantrasyonları 96 saat boyunca test edildi. Kronik testte, doğal olarak oluşan sipermetrin konsantrasyonları (1, 3, 6 ve 20 μg/L) ölüm oranı için test edildi, ardından 7 gün boyunca mikronükleus testi ve kırmızı kan hücresi nükleer anormallikleri yapıldı. Ticari sipermetrin formülasyonunun kurbağa yavrularına LC50 değeri 273,41 μg L−1 idi. Kronik testte, en yüksek konsantrasyon (20 μg L−1), test edilen kurbağa yavrularının yarısını öldürdüğü için %50'den fazla ölüm oranına neden oldu. Mikronükleus testi 6 ve 20 μg L−1'de önemli sonuçlar gösterdi ve birkaç nükleer anormallik tespit edildi; bu da ticari sipermetrin formülasyonunun P. gracilis'e karşı genotoksik potansiyele sahip olduğunu gösteriyordu. Sipermetrin bu tür için yüksek risk taşımaktadır ve bu da çok sayıda soruna yol açabileceğini ve kısa ve uzun vadede bu ekosistemin dinamiklerini etkileyebileceğini göstermektedir. Bu nedenle ticari sipermetrin formülasyonlarının P. gracilis üzerinde toksik etkilere sahip olduğu sonucuna varılabilir.
Tarımsal faaliyetlerin sürekli genişlemesi ve yoğun bir şekilde uygulanması nedeniyle,haşere kontrolüÖnlemler nedeniyle su hayvanları sıklıkla pestisitlere maruz kalmaktadır1,2. Tarım alanlarının yakınındaki su kaynaklarının kirlenmesi, amfibiler gibi hedef dışı organizmaların gelişimini ve hayatta kalmasını etkileyebilir.
Amfibiler çevresel matrislerin değerlendirilmesinde giderek daha önemli hale geliyor. Anuranlar, karmaşık yaşam döngüleri, hızlı larva büyüme oranları, trofik durum, geçirgen deri10,11, üreme için suya bağımlılık12 ve korunmasız yumurtalar11,13,14 gibi benzersiz özellikleri nedeniyle çevre kirleticilerinin iyi biyoindikatörleri olarak kabul edilirler. Yaygın olarak ağlayan kurbağa olarak bilinen küçük su kurbağasının (Physalaemus gracilis), pestisit kirliliğinin biyoindikatör türü olduğu gösterilmiştir4,5,6,7,15. Bu tür, Arjantin, Uruguay, Paraguay ve Brezilya'daki durgun sularda, korunan alanlarda veya değişken habitatlı alanlarda bulunur1617 ve geniş dağılımı ve farklı habitatlara toleransı nedeniyle IUCN sınıflandırmasına göre stabil kabul edilir18.
Sipermetrin maruziyetinden sonra amfibilerde davranışsal, morfolojik ve biyokimyasal değişiklikler23,24,25, değişen ölüm oranı ve metamorfoz süresi, enzimatik değişiklikler, azalmış yumurtadan çıkma başarısı24,25, hiperaktivite26, kolinesteraz aktivitesinin inhibisyonu27 ve yüzme performansında değişiklikler7,28 dahil olmak üzere subletal etkiler bildirilmiştir. Ancak amfibilerde sipermetrinin genotoksik etkilerine ilişkin çalışmalar sınırlıdır. Bu nedenle, anuran türlerinin sipermetrine duyarlılığını değerlendirmek önemlidir.
Çevre kirliliği amfibilerin normal büyümesini ve gelişimini etkiler, ancak en ciddi olumsuz etki pestisit maruziyetinin neden olduğu DNA'daki genetik hasardır13. Kan hücresi morfolojisi analizi kirliliğin ve bir maddenin vahşi türler için potansiyel toksisitesinin önemli bir biyoindikatörüdür29. Mikronükleus testi, kimyasalların çevredeki genotoksisitesini belirlemek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir30. Amfibiler gibi organizmaların kimyasal kirliliğinin iyi bir göstergesi olan hızlı, etkili ve ucuz bir yöntemdir31,32 ve genotoksik kirleticilere maruz kalma hakkında bilgi sağlayabilir33.
Bu çalışmanın amacı, mikronükleus testi ve ekolojik risk değerlendirmesi kullanarak ticari sipermetrin formülasyonlarının küçük su kurbağa yavruları üzerindeki toksik potansiyelini değerlendirmektir.
Testin akut döneminde farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin'e maruz kalan P. gracilis kurbağa yavrularının kümülatif ölüm oranı (%).
Kronik bir test sırasında farklı konsantrasyonlarda ticari sipermetrin'e maruz bırakılan P. gracilis kurbağa yavrularının kümülatif ölüm oranı (%).
Gözlemlenen yüksek ölüm oranı, farklı sipermetrin konsantrasyonlarına (6 ve 20 μg/L) maruz kalan amfibilerde genotoksik etkilerin bir sonucuydu; bu durum eritrositlerdeki mikronükleusların (MN) ve nükleer anormalliklerin varlığıyla kanıtlanmıştır. MN oluşumu mitozdaki hataları gösterir ve kromozomların mikrotübüllere zayıf bağlanması, kromozom alımı ve taşınmasından sorumlu protein komplekslerindeki kusurlar, kromozom ayrışmasındaki hatalar ve DNA hasarı onarımındaki hatalarla ilişkilidir38,39 ve pestisit kaynaklı oksidatif stresle ilişkili olabilir40,41. Değerlendirilen tüm konsantrasyonlarda başka anormallikler de gözlendi. Sipermetrin konsantrasyonlarının artması, eritrositlerdeki nükleer anormallikleri sırasıyla en düşük (1 μg/L) ve en yüksek (20 μg/L) dozlarda %5 ve %20 oranında artırdı. Örneğin, bir türün DNA'sındaki değişiklikler hem kısa hem de uzun vadeli hayatta kalma için ciddi sonuçlara yol açabilir ve popülasyon azalmasına, değişen üreme uygunluğuna, akraba evliliğine, genetik çeşitliliğin kaybına ve değişen göç oranlarına neden olabilir. Tüm bu faktörler türlerin hayatta kalmasını ve sürdürülmesini etkileyebilir42,43. Eritroid anormalliklerin oluşumu sitokinezde bir blok olduğunu gösterebilir ve bu da anormal hücre bölünmesine (çift çekirdekli eritrositler) neden olabilir44,45; çok loblu çekirdekler, çok sayıda loba sahip nükleer membran çıkıntılarıdır46, diğer eritroid anormallikler ise nükleer böbrekler/kabarcıklar gibi DNA amplifikasyonuyla ilişkili olabilir47. Nükleussuz eritrositlerin varlığı, özellikle kirli suda bozulmuş oksijen taşınımına işaret edebilir48,49. Apoptoz hücre ölümünü gösterir50.
Diğer çalışmalar da sipermetrinin genotoksik etkilerini göstermiştir. Kabaña ve ark.51 Odontophrynus americanus hücrelerinde 96 saat boyunca yüksek konsantrasyonlarda sipermetrin (5000 ve 10.000 μg L−1) maruziyetinden sonra mikronükleus ve nükleer değişimlerin (binükleer hücreler ve apoptotik hücreler gibi) varlığını göstermiştir. Sipermetrin kaynaklı apoptozis ayrıca P. biligonigerus52 ve Rhinella arenarum53'ta da tespit edilmiştir. Bu sonuçlar sipermetrinin bir dizi su organizması üzerinde genotoksik etkilere sahip olduğunu ve MN ve ENA testinin amfibiler üzerinde subletal etkilerin bir göstergesi olabileceğini ve toksik maddelere maruz kalan yerli türlere ve vahşi popülasyonlara uygulanabilir olabileceğini göstermektedir12.
Sipermetrinin ticari formülasyonları, türlerde olumsuz etkilere neden olabilecek ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) düzeyini54 aşan HQ'larla yüksek bir çevresel tehlike (hem akut hem de kronik) oluşturmaktadır. Kronik risk değerlendirmesinde, ölüm oranı için NOEC 3 μg L−1 idi ve bu, suda bulunan konsantrasyonların türler için risk oluşturabileceğini doğrulamaktadır55. Endosülfan ve sipermetrin karışımına maruz kalan R. arenarum larvaları için öldürücü NOEC, 168 saat sonra 500 μg L−1 idi; bu değer 336 saat sonra 0,0005 μg L−1'e düşmüştür. Yazarlar, maruziyet süresi ne kadar uzun olursa türler için zararlı olan konsantrasyonların o kadar düşük olduğunu göstermektedir. Ayrıca, NOEC değerlerinin aynı maruziyet süresinde P. gracilis'in değerlerinden daha yüksek olduğunu ve bunun türlerin sipermetrin'e verdiği tepkinin türe özgü olduğunu gösterdiğini vurgulamak da önemlidir. Ayrıca, ölüm oranı açısından, P. gracilis'in sipermetrin maruziyetinden sonraki CHQ değeri, ABD Çevre Koruma Ajansı'nın54 belirlediği referans değerinden daha yüksek olan 64.67'ye ulaşmış ve R. arenarum larvalarının CHQ değeri de bu değerden daha yüksek olmuştur (336 saat sonra CHQ > 388.00), bu da çalışılan insektisitlerin çeşitli amfibi türleri için yüksek risk oluşturduğunu göstermektedir. P. gracilis'in metamorfozunu tamamlaması için yaklaşık 30 güne ihtiyaç duyduğu düşünüldüğünde56, çalışılan sipermetrin konsantrasyonlarının, enfekte bireylerin erken yaşta yetişkin veya üreme aşamasına girmesini önleyerek popülasyon düşüşüne katkıda bulunabileceği sonucuna varılabilir.
Mikronükleus ve diğer eritrosit nükleer anormalliklerinin hesaplanan risk değerlendirmesinde CHQ değerleri 14.92 ila 97.00 arasında değişmiş olup, sipermetrinin doğal ortamında bile P. gracilis için potansiyel bir genotoksik risk taşıdığını göstermektedir. Ölüm oranı da hesaba katıldığında, P. gracilis için tolere edilebilir ksenobiyotik bileşiklerin maksimum konsantrasyonu 4.24 μg L−1 olmuştur. Ancak, 1 μg/L kadar düşük konsantrasyonlar bile genotoksik etkiler göstermiştir. Bu durum anormal bireylerin sayısında artışa57 yol açabilir ve türlerin yaşam alanlarındaki gelişimini ve üremesini etkileyerek amfibi popülasyonlarında azalmaya neden olabilir.
Böcek ilacı sipermetrinin ticari formülasyonları P. gracilis'e karşı yüksek akut ve kronik toksisite gösterdi. Mikronükleus ve eritrosit nükleer anormalliklerinin, özellikle tırtıklı çekirdekler, loblu çekirdekler ve veziküler çekirdeklerin varlığıyla kanıtlandığı üzere, muhtemelen toksik etkilerden kaynaklanan daha yüksek ölüm oranları gözlendi. Ek olarak, incelenen türler hem akut hem de kronik olarak artan çevresel riskler gösterdi. Bu veriler, araştırma grubumuz tarafından yapılan önceki çalışmalarla birleştirildiğinde, sipermetrinin farklı ticari formülasyonlarının bile hala asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE) aktivitelerinde ve oksidatif streste azalmaya neden olduğunu58 ve P. gracilis'te yüzme aktivitesinde ve oral malformasyonlarda değişikliklere59 yol açtığını göstererek, sipermetrinin ticari formülasyonlarının bu türe karşı yüksek öldürücü ve öldürücü olmayan toksisiteye sahip olduğunu göstermektedir. Hartmann ve ark. 60, sipermetrin'in ticari formülasyonlarının P. gracilis ve aynı cinsin başka bir türü (P. cuvieri) için dokuz diğer pestisitle karşılaştırıldığında en toksik olduğunu buldu. Bu, çevre koruma için yasal olarak onaylanmış sipermetrin konsantrasyonlarının yüksek ölüm oranına ve uzun vadeli nüfus düşüşüne yol açabileceğini göstermektedir.
Pestisitin amfibiler için toksisitesini değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır, çünkü çevrede bulunan konsantrasyonlar yüksek ölüm oranına neden olabilir ve P. gracilis için potansiyel bir risk oluşturabilir. Amfibi türleri üzerine araştırmalar teşvik edilmelidir, çünkü bu organizmalar hakkında, özellikle Brezilya türleri hakkında veriler azdır.
Kronik toksisite testi statik koşullar altında 168 saat (7 gün) sürdü ve öldürücü olmayan konsantrasyonlar şunlardı: 1, 3, 6 ve 20 μg ai L−1. Her iki deneyde de, tedavi grubu başına 10 kurbağa yavrusu altı tekrarla değerlendirildi ve konsantrasyon başına toplam 60 kurbağa yavrusu oldu. Bu arada, sadece su tedavisi negatif kontrol görevi gördü. Her deney düzeneği, 500 ml kapasiteli ve 50 ml çözelti başına 1 kurbağa yavrusu yoğunluğunda steril bir cam kaptan oluşuyordu. Buharlaşmayı önlemek için şişe polietilen filmle kapatıldı ve sürekli olarak havalandırıldı.
Su, 0, 96 ve 168. saatlerde pestisit konsantrasyonlarını belirlemek için kimyasal olarak analiz edildi. Sabin ve ark. 68 ve Martins ve ark. 69'a göre analizler, üçlü dört kutuplu kütle spektrometrisine (Varian model 1200, Palo Alto, Kaliforniya, ABD) bağlı gaz kromatografisi kullanılarak Santa Maria Federal Üniversitesi Pestisit Analiz Laboratuvarı'nda (LARP) gerçekleştirildi. Sudaki pestisitlerin kantitatif tayini ek materyal olarak gösterilmiştir (Tablo SM1).
Mikronükleus testi (MNT) ve kırmızı hücre nükleer anormallik testi (RNA) için her tedavi grubundan 15 kurbağa yavrusu analiz edildi. Kurbağa yavruları %5 lidokainle (50 mg g-170) anestezi altına alındı ve tek kullanımlık heparinize şırıngalar kullanılarak kardiyak ponksiyonla kan örnekleri toplandı. Kan yaymaları steril mikroskop slaytları üzerinde hazırlandı, hava ile kurutuldu, %100 metanolle (4 °C) 2 dakika fiksasyon yapıldı ve ardından karanlıkta 15 dakika %10 Giemsa solüsyonuyla boyandı. İşlemin sonunda, fazla boyayı çıkarmak için slaytlar damıtılmış suyla yıkandı ve oda sıcaklığında kurutuldu.
Her kurbağa yavrusundan en az 1000 alyuvar, MN ve ENA'nın varlığını belirlemek için 71 objektifli 100x mikroskop kullanılarak analiz edildi. Kurbağa yavrularından toplam 75.796 alyuvar, sipermetrin konsantrasyonları ve kontroller dikkate alınarak değerlendirildi. Genotoksisite, aşağıdaki nükleer lezyonların sıklığını belirleyerek Carrasco ve ark. ve Fenech ve ark.'nın yöntemine göre analiz edildi.38,72: (1) anükleat hücreler: çekirdeği olmayan hücreler; (2) apoptotik hücreler: nükleer parçalanma, programlanmış hücre ölümü; (3) binükleat hücreler: iki çekirdeği olan hücreler; (4) nükleer tomurcuklar veya bleb hücreleri: nükleer membranın küçük çıkıntılarına sahip çekirdeklere sahip hücreler, mikronükleuslara benzer büyüklükte blebler; (5) karyolize hücreler: iç materyali olmayan sadece çekirdeğin ana hatları olan hücreler; (6) çentikli hücreler: şekillerinde belirgin çatlaklar veya çentikler bulunan çekirdeklere sahip hücreler, böbrek şeklindeki çekirdekler olarak da adlandırılır; (7) lobüle hücreler: yukarıda belirtilen veziküllerden daha büyük nükleer çıkıntılara sahip hücreler; ve (8) mikro hücreler: yoğunlaşmış çekirdeklere ve azaltılmış sitoplazmaya sahip hücreler. Değişiklikler negatif kontrol sonuçlarıyla karşılaştırıldı.
Akut toksisite test sonuçları (LC50) GBasic yazılımı ve TSK-Trimmed Spearman-Karber yöntemi74 kullanılarak analiz edildi. Kronik test verileri hata normalliği (Shapiro-Wilks) ve varyans homojenliği (Bartlett) açısından önceden test edildi. Sonuçlar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. Tukey testi verileri kendi aralarında karşılaştırmak için kullanıldı ve Dunnett testi tedavi grubu ile negatif kontrol grubu arasındaki verileri karşılaştırmak için kullanıldı.
LOEC ve NOEC verileri Dunnett testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel testler %95 anlamlılık düzeyiyle (p < 0,05) Statistica 8.0 yazılımı (StatSoft) kullanılarak gerçekleştirildi.
Gönderi zamanı: Mar-13-2025