DELLA proteinleri korunurbüyüme düzenleyicileribitki gelişiminde iç ve dış sinyallere yanıt olarak merkezi bir rol oynayan. Transkripsiyonel düzenleyiciler olarak DELLA'lar, GRAS alanları aracılığıyla transkripsiyon faktörlerine (TF'ler) ve histon H2A'ya bağlanır ve promotörler üzerinde etki etmek üzere işe alınır. Son çalışmalar, DELLA stabilitesinin translasyon sonrası iki mekanizma tarafından düzenlendiğini göstermiştir: bitki hormonu tarafından indüklenen poliübikitinasyonciberelin, hızlı bozunmalarına ve birikimlerini artıran küçük ubikitin benzeri değiştirici (SUMO) ile konjugasyona yol açar. Dahası, DELLA aktivitesi iki ayrı glikozilasyon mekanizması tarafından dinamik olarak düzenlenir: O-fukozilasyon DELLA-TF etkileşimini arttırırken, O-bağlı N-asetilglukozamin (O-GlcNAc) modifikasyonu DELLA-TF etkileşimini engeller. Ancak, önceki çalışmalar çelişkili sonuçlar gösterdiğinden DELLA fosforilasyonunun rolü belirsizdir; bazıları fosforilasyonun DELLA bozunmasını desteklediğini veya baskıladığını öne sürerken, diğerleri fosforilasyonun stabilitelerini etkilemediğini öne sürmektedir. Burada, kütle spektrometrisi ile Arabidopsis thaliana'dan saflaştırılan GA1-3 baskılayıcı (RGA), AtDELLA'daki fosforilasyon bölgelerini belirliyoruz ve PolyS ve PolyS/T bölgelerindeki iki RGA peptidinin fosforilasyonunun H2A bağlanmasını ve RGA'nın hedef promotörlerle ilişkisini teşvik ederek RGA aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Özellikle fosforilasyon, RGA-TF etkileşimlerini veya RGA stabilitesini etkilemedi. Çalışmamız, fosforilasyonun DELLA aktivitesini indüklediği moleküler bir mekanizmayı ortaya koyuyor.
Kütle spektrometrik analizimiz, Pep1 ve Pep2'nin her ikisinin de GA-eksik Ga1 arka planında RGA'da yüksek oranda fosforile edildiğini ortaya koydu. Bu çalışmaya ek olarak, fosfoproteomik çalışmalar da RGA'da Pep1 fosforilasyonunu ortaya koydu, ancak rolü henüz incelenmedi53,54,55. Buna karşılık, Pep2 fosforilasyonu daha önce tanımlanmamıştı çünkü bu peptit yalnızca RGAGKG transgeni kullanılarak tespit edilebiliyordu. Pep1 fosforilasyonunu ortadan kaldıran m1A mutasyonu, RGA aktivitesini planta'da yalnızca hafifçe azaltsa da, m2A ile birleştirildiğinde RGA aktivitesini azaltmada ek bir etkiye sahipti (Ek Şekil 6). Önemlisi, Pep1 fosforilasyonu, GA-geliştirilmiş sly1 mutantında ga1'e kıyasla önemli ölçüde azaldı ve bu da GA'nın RGA defosforilasyonunu teşvik ederek aktivitesini azalttığını düşündürmektedir. GA'nın RGA fosforilasyonunu baskıladığı mekanizma daha fazla araştırma gerektirmektedir. Bir olasılık, bunun tanımlanmamış bir protein kinazının düzenlenmesi yoluyla elde edilmiş olmasıdır. Çalışmalar, CK1 protein kinaz EL1 ifadesinin rice41'de GA tarafından aşağı düzenlendiğini göstermiş olsa da, sonuçlarımız Arabidopsis EL1 homologunun (AEL1-4) daha yüksek dereceli mutasyonlarının RGA fosforilasyonunu azaltmadığını göstermektedir. Sonuçlarımızla uyumlu olarak, Arabidopsis AEL aşırı ifade eden hatlar ve bir ael üçlü mutantı kullanılarak yapılan yakın tarihli bir fosfoproteomik çalışma, bu kinazların substratları olarak herhangi bir DELLA proteini tanımlamamıştır56. El yazmasını hazırladığımızda, buğdayda (Triticum aestivum) bir GSK3/SHAGGY benzeri kinazı kodlayan gen olan GSK3'ün DELLA'yı (Rht-B1b) fosforile edebileceği bildirildi57, ancak Rht-B1b'nin GSK3 tarafından fosforilasyonu plantada doğrulanmamıştır. GSK3 varlığında in vitro enzimatik reaksiyonlar ve ardından kütle spektrometrisi analizi, Rht-B1b'nin DELLA ve GRAS alanları arasında bulunan üç fosforilasyon bölgesini ortaya çıkardı (Ek Şekil 3). Her üç fosforilasyon bölgesindeki serinden alanine ikameler, transgenik buğdayda Rht-B1b aktivitesinin azalmasına neden oldu; bu, Pep2 RGA'daki alanin ikamelerinin RGA aktivitesini azalttığına dair bulgularımızla tutarlıdır. Ancak, in vitro protein bozunma testleri, fosforilasyonun Rht-B1b57'yi de stabilize edebileceğini daha da göstermiştir. Bu, Pep2 RGA'daki alanin ikamelerinin plantadaki stabilitesini değiştirmediğini gösteren sonuçlarımızla çelişmektedir. Buğdaydaki GSK3, Arabidopsis'teki brassinosteroid-duyarsız protein 2'nin (BIN2) bir ortologudur 57. BIN2, BR sinyallemesinin negatif bir düzenleyicisidir ve BR, BIN2 bozunumuna neden olarak sinyal yolunu aktive eder 58. BR tedavisinin Arabidopsis'te RGA stabilitesini 59 veya fosforilasyon seviyelerini azaltmadığını gösterdik (Ek Şekil 2), bu da RGA'nın BIN2 tarafından fosforile edilmesinin muhtemel olmadığını düşündürmektedir.
Tüm nicel veriler Excel kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi ve anlamlı farklılıklar Student'ın t-testi kullanılarak belirlendi. Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için hiçbir istatistiksel yöntem kullanılmadı. Analizden hiçbir veri hariç tutulmadı; deney rastgeleleştirilmedi; ve araştırmacılar deney ve sonuç değerlendirmesi sırasında tahsisin farkındaydı. Örneklem büyüklükleri şekil açıklamalarında ve ham veri dosyalarında verilmiştir.
Gönderi zamanı: 15-Nis-2025