DELLA proteinleri korunurbüyüme düzenleyicileriİç ve dış sinyallere yanıt olarak bitki gelişiminde merkezi bir rol oynayan DELLA'lar, transkripsiyonel düzenleyiciler olarak, GRAS bölgeleri aracılığıyla transkripsiyon faktörlerine (TF'ler) ve histon H2A'ya bağlanır ve promotörler üzerinde etki etmek üzere görevlendirilir. Son çalışmalar, DELLA stabilitesinin translasyon sonrası iki mekanizma tarafından düzenlendiğini göstermiştir: bitki hormonu tarafından indüklenen poliübikitinasyongibberellin, hızlı bozunmalarına ve birikimlerini artıran küçük ubikitin benzeri değiştirici (SUMO) ile konjugasyona yol açar. Dahası, DELLA aktivitesi iki ayrı glikozilasyon mekanizması tarafından dinamik olarak düzenlenir: O-fukozilasyon DELLA-TF etkileşimini arttırırken, O-bağlı N-asetilglukozamin (O-GlcNAc) modifikasyonu DELLA-TF etkileşimini engeller. Ancak, DELLA fosforilasyonunun rolü belirsizdir çünkü önceki çalışmalar çelişkili sonuçlar göstermiştir; bazıları fosforilasyonun DELLA bozunmasını desteklediğini veya baskıladığını öne sürerken, diğerleri fosforilasyonun stabilitelerini etkilemediğini öne sürmektedir. Burada, kütle spektrometrisi ile Arabidopsis thaliana'dan saflaştırılan GA1-3 baskılayıcı (RGA), AtDELLA'daki fosforilasyon bölgelerini belirliyoruz ve PolyS ve PolyS/T bölgelerindeki iki RGA peptidinin fosforilasyonunun, H2A bağlanmasını ve RGA'nın hedef promotörlerle ilişkisini teşvik ederek RGA aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Fosforilasyonun RGA-TF etkileşimlerini veya RGA stabilitesini etkilemediği dikkat çekicidir. Çalışmamız, fosforilasyonun DELLA aktivitesini nasıl indüklediğine dair moleküler bir mekanizmayı ortaya koymaktadır.
Kütle spektrometrik analizimiz, Pep1 ve Pep2'nin her ikisinin de GA eksik Ga1 arka planında RGA'da yüksek oranda fosforile olduğunu ortaya koydu. Bu çalışmaya ek olarak, fosfoproteomik çalışmalar da RGA'da Pep1 fosforilasyonunu ortaya koydu, ancak rolü henüz incelenmedi53,54,55. Buna karşılık, Pep2 fosforilasyonu daha önce tanımlanmamıştı çünkü bu peptit yalnızca RGAGKG transgeni kullanılarak tespit edilebiliyordu. Pep1 fosforilasyonunu ortadan kaldıran m1A mutasyonu, planta'daki RGA aktivitesini yalnızca hafifçe azaltsa da, m2A ile birleştirildiğinde RGA aktivitesini azaltmada ek bir etkiye sahipti (Ek Şekil 6). Önemlisi, Pep1 fosforilasyonu, GA tarafından geliştirilen sly1 mutantında ga1 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaldı; bu da GA'nın RGA defosforilasyonunu teşvik ederek aktivitesini azalttığını düşündürmektedir. GA'nın RGA fosforilasyonunu baskıladığı mekanizma daha fazla araştırma gerektirmektedir. Bir olasılık, bunun tanımlanmamış bir protein kinazının düzenlenmesiyle elde edilmiş olmasıdır. Çalışmalar, CK1 protein kinaz EL1 ifadesinin pirinçte GA tarafından aşağı düzenlendiğini gösterse de41, sonuçlarımız Arabidopsis EL1 homologunun (AEL1-4) daha yüksek mertebeden mutasyonlarının RGA fosforilasyonunu azaltmadığını göstermektedir. Sonuçlarımızla uyumlu olarak, Arabidopsis AEL aşırı ifade eden hatları ve bir ael üçlü mutantını kullanan yakın tarihli bir fosfoproteomik çalışma, bu kinazların substratı olarak herhangi bir DELLA proteinini tanımlamamıştır56. Makaleyi hazırladığımızda, buğdayda (Triticum aestivum) bir GSK3/SHAGGY benzeri kinazı kodlayan gen olan GSK3'ün DELLA'yı (Rht-B1b) fosforile edebileceği bildirilmiştir57, ancak Rht-B1b'nin GSK3 tarafından fosforilasyonu plantada doğrulanmamıştır. GSK3 varlığında in vitro enzimatik reaksiyonlar ve ardından kütle spektrometrisi analizi, Rht-B1b'nin DELLA ve GRAS bölgeleri arasında yer alan üç fosforilasyon bölgesini ortaya çıkardı (Ek Şekil 3). Her üç fosforilasyon bölgesindeki serin-alanin ikameleri, transgenik buğdayda Rht-B1b aktivitesinde azalmaya neden oldu. Bu, Pep2 RGA'daki alanin ikamelerinin RGA aktivitesini azalttığına dair bulgularımızla tutarlıdır. Bununla birlikte, in vitro protein bozunma testleri, fosforilasyonun Rht-B1b57'yi de stabilize edebileceğini göstermiştir. Bu, Pep2 RGA'daki alanin ikamelerinin bitkideki stabilitesini değiştirmediğini gösteren sonuçlarımızla çelişmektedir. Buğdaydaki GSK3, Arabidopsis'teki brassinosteroid-duyarsız protein 2'nin (BIN2) bir ortologudur 57. BIN2, BR sinyallemesinin negatif bir düzenleyicisidir ve BR, BIN2 bozunumuna neden olarak sinyal yolunu aktive eder 58. BR tedavisinin Arabidopsis'te RGA stabilitesini 59 veya fosforilasyon seviyelerini azaltmadığını gösterdik (Ek Şekil 2), bu da RGA'nın BIN2 tarafından fosforile edilmesinin olası olmadığını düşündürmektedir.
Tüm nicel veriler Excel kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi ve anlamlı farklılıklar Student t-testi kullanılarak belirlendi. Örneklem büyüklüğünü önceden belirlemek için herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılmadı. Analizden hiçbir veri çıkarılmadı; deney rastgeleleştirilmedi ve araştırmacılar deney ve sonuç değerlendirmesi sırasında dağılımdan haberdar edildi. Örneklem büyüklükleri, şekil alt yazılarında ve ham veri dosyalarında sunulmaktadır.
Gönderi zamanı: 15 Nis 2025