Sürgün apikal meristem (SAM) büyümesi gövde mimarisi için kritik öneme sahiptir. Bitki hormonlarıciberellinler(GA'lar) bitki büyümesini koordine etmede önemli roller oynarlar, ancak SAM'deki rolleri yeterince anlaşılmamıştır. Burada, GA transkripsiyonel yanıtındaki temel düzenleyici işlevini bastırmak ve GA tanınması üzerine bozunmasını korumak için DELLA proteinini tasarlayarak GA sinyallemesinin oransal bir biyosensörünü geliştirdik. Bu bozunmaya dayalı biyosensörün, gelişim sırasında GA seviyelerindeki ve hücresel algılamadaki değişiklikleri doğru bir şekilde kaydettiğini gösteriyoruz. Bu biyosensörü, SAM'deki GA sinyalleme aktivitesini haritalamak için kullandık. Yüksek GA sinyallerinin, internod hücrelerinin öncüleri olan organ primordiaları arasında bulunan hücrelerde baskın olarak bulunduğunu gösteriyoruz. İşlev kazanımı ve kaybı yaklaşımlarını kullanarak, GA'nın hücre bölünme düzleminin yönelimini düzenlediğini, internodların kanonik hücresel organizasyonunu oluşturduğunu ve böylece SAM'de internod spesifikasyonunu desteklediğini daha da gösteriyoruz.
Sürgün tepesinde bulunan sürgün apikal meristemi (SAM), bitkinin ömrü boyunca modüler ve yinelemeli bir şekilde yanal organlar ve kök düğümleri oluşturan aktivitesi olan bir kök hücre nişi içerir. Bu tekrarlayan birimlerin veya bitki düğümlerinin her biri, düğümlerdeki internodları ve yanal organları ve yaprak aksillerindeki aksiller meristemleri içerir1. Bitki düğümlerinin büyümesi ve organizasyonu gelişim sırasında değişir. Arabidopsis'te, internodal büyüme vejetatif aşamada baskılanır ve aksiller meristemler rozet yapraklarının aksillerinde uykuda kalır. Çiçeklenme evresine geçiş sırasında SAM, çiçek salkımı meristemi haline gelir ve uzun internodlar ve aksiller tomurcuklar, gövde yapraklarının aksillerindeki dalcıklar ve daha sonra yapraksız çiçekler2 oluşturur. Yaprakların, çiçeklerin ve dalların başlangıcını kontrol eden mekanizmaları anlamada önemli ilerleme kaydetmiş olsak da, internodların nasıl ortaya çıktığı hakkında nispeten az şey bilinmektedir.
GA'ların uzaysal ve zamansal dağılımını anlamak, bu hormonların farklı dokularda ve farklı gelişim aşamalarındaki işlevlerini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Kendi promotörünün etkisi altında ifade edilen RGA-GFP füzyonunun bozunmasının görselleştirilmesi, köklerdeki toplam GA seviyelerinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlar15,16. Ancak, RGA ifadesi dokular arasında değişir17 ve GA18 tarafından düzenlenir. Bu nedenle, RGA promotörünün farklı ifadesi, RGA-GFP ile gözlenen floresan desenine neden olabilir ve bu nedenle bu yöntem niceliksel değildir. Daha yakın zamanda, biyoaktif floresan (Fl) etiketli GA19,20, kök endokorteksinde GA birikimini ve hücresel seviyelerinin GA taşınmasıyla düzenlenmesini ortaya koydu. Son zamanlarda, GA FRET sensörü nlsGPS1, GA seviyelerinin köklerde, filamentlerde ve karanlıkta yetiştirilen hipokotillerde hücre uzamasıyla ilişkili olduğunu gösterdi21. Ancak gördüğümüz gibi, GA konsantrasyonu GA sinyalleme aktivitesini kontrol eden tek parametre değildir, çünkü karmaşık algılama süreçlerine bağlıdır. Burada, DELLA ve GA sinyalleme yollarına ilişkin anlayışımızı temel alarak, GA sinyallemesi için bozunmaya dayalı bir oranlı metrik biyosensörün geliştirilmesini ve karakterizasyonunu bildiriyoruz. Bu kantitatif biyosensörü geliştirmek için, floresan bir proteine kaynaştırılmış ve dokularda yaygın olarak ifade edilen mutant bir GA-duyarlı RGA ve ayrıca GA'ya duyarsız bir floresan protein kullandık. Mutant RGA protein füzyonlarının, yaygın olarak ifade edildiğinde endojen GA sinyallemesine müdahale etmediğini ve bu biyosensörün hem GA girdisinden hem de algılama aygıtı tarafından GA sinyal işlemesinden kaynaklanan sinyalleme aktivitesini yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükle ölçebildiğini gösteriyoruz. Bu biyosensörü, GA sinyalleme aktivitesinin uzaysal-zamansal dağılımını haritalamak ve GA'nın SAM epidermisinde hücresel davranışı nasıl düzenlediğini ölçmek için kullandık. GA'nın organ primordiaları arasında yer alan SAM hücrelerinin bölünme düzleminin yönelimini düzenlediğini ve böylece internodun kanonik hücresel organizasyonunu tanımladığını gösteriyoruz.
Son olarak, qmRGA'nın büyüyen hipokotilleri kullanarak endojen GA seviyelerindeki değişiklikleri raporlayıp raporlayamayacağını sorduk. Daha önce nitratın GA sentezini ve dolayısıyla DELLA34 bozunmasını artırarak büyümeyi uyardığını göstermiştik. Buna göre, bol nitrat kaynağı (10 mM NO3−) altında yetiştirilen pUBQ10::qmRGA fidelerindeki hipokotil uzunluğunun nitrat eksikliği olan koşullar altında yetiştirilen fidelere göre önemli ölçüde daha uzun olduğunu gözlemledik (Ek Şekil 6a). Büyüme tepkisiyle tutarlı olarak, GA sinyalleri 10 mM NO3− koşulları altında yetiştirilen fidelerin hipokotillerinde nitrat yokluğunda yetiştirilen fidelere göre daha yüksekti (Ek Şekil 6b, c). Bu nedenle, qmRGA ayrıca GA konsantrasyonundaki endojen değişiklikler tarafından indüklenen GA sinyallemesindeki değişikliklerin izlenmesini de sağlar.
qmRGA tarafından tespit edilen GA sinyal aktivitesinin, sensör tasarımına göre beklendiği gibi GA konsantrasyonuna ve GA algısına bağlı olup olmadığını anlamak için vejetatif ve üreme dokularındaki üç GID1 reseptörünün ifadesini analiz ettik. Fidelerde, GID1-GUS muhabir hattı GID1a ve c'nin kotiledonlarda yüksek oranda ifade edildiğini gösterdi (Şekil 3a–c). Ek olarak, üç reseptörün tamamı yapraklarda, yan kök taslaklarında, kök uçlarında (GID1b'nin kök başlığı hariç) ve vasküler sistemde ifade edildi (Şekil 3a–c). Çiçeklenme SAM'inde, yalnızca GID1b ve 1c için GUS sinyalleri tespit ettik (Ek Şekil 7a–c). Yerinde hibridizasyon bu ifade modellerini doğruladı ve ayrıca GID1c'nin SAM'de düşük seviyelerde düzgün bir şekilde ifade edildiğini, buna karşın GID1b'nin SAM'in çevresinde daha yüksek ifade gösterdiğini gösterdi (Ek Şekil 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasyonel füzyonu ayrıca SAM'ın merkezinde düşük veya hiç ifade olmamasından organ sınırlarında yüksek ifadeye kadar derecelendirilmiş bir GID1b ifadesi aralığını ortaya koydu (Ek Şekil 7m). Bu nedenle, GID1 reseptörleri dokular arasında ve içinde eşit olarak dağılmamıştır. Sonraki deneylerde, GID1'in (pUBQ10::GID1a-mCherry) aşırı ifadesinin, hipokotillerdeki qmRGA'nın harici GA uygulamasına duyarlılığını artırdığını da gözlemledik (Şekil 3d, e). Buna karşılık, hipokotilde qd17mRGA tarafından ölçülen floresans, GA3 işlemine duyarsızdı (Şekil 3f, g). Her iki deney için de, fideler, GID1 reseptörüne bağlanma yeteneğinin arttığı veya kaybolduğu sensörün hızlı davranışını değerlendirmek için yüksek konsantrasyonlarda GA (100 μM GA3) ile işlendi. Bu sonuçlar bir arada, qmRGA biyosensörünün GA ve GA sensörü olarak kombine bir işlev gördüğünü doğruluyor ve GID1 reseptörünün farklı ekspresyonunun sensörün emisivitesini önemli ölçüde modüle edebileceğini öne sürüyor.
Bugüne kadar, SAM'deki GA sinyallerinin dağılımı belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, GA sinyal aktivitesinin yüksek çözünürlüklü kantitatif haritalarını hesaplamak için qmRGA ifade eden bitkiler ve pCLV3::mCherry-NLS kök hücre muhabirini35 kullandık ve L1 katmanına (epidermis; Şekil 4a, b, Yöntemler ve Ek Yöntemler'e bakın) odaklandık, çünkü L1, SAM büyümesini kontrol etmede önemli bir rol oynar36. Burada, pCLV3::mCherry-NLS ifadesi, GA sinyal aktivitesinin uzaysal ve zamansal dağılımını analiz etmek için sabit bir geometrik referans noktası sağladı37. GA, lateral organ gelişimi için gerekli kabul edilmesine rağmen4, GA sinyallerinin çiçek primordiyumunda (P) P3 aşamasından başlayarak düşük olduğunu (Şekil 4a, b) gözlemledik, buna karşın genç P1 ve P2 primordiyumları, merkezi bölgedekine benzer şekilde orta düzeyde aktiviteye sahipti (Şekil 4a, b). Organ primordium sınırlarında, P1/P2'den (sınırın kenarlarında) başlayıp P4'te zirveye ulaşan ve primordialar arasında bulunan periferik bölgenin tüm hücrelerinde daha yüksek GA sinyal aktivitesi tespit edildi (Şekil 4a, b ve Ek Şekil 8a, b). Bu daha yüksek GA sinyal aktivitesi sadece epidermiste değil aynı zamanda L2 ve üst L3 katmanlarında da gözlendi (Ek Şekil 8b). qmRGA kullanılarak SAM'de tespit edilen GA sinyallerinin örüntüsü de zamanla değişmeden kaldı (Ek Şekil 8c–f, k). Ayrıntılı olarak karakterize ettiğimiz beş bağımsız hattan T3 bitkilerinin SAM'sinde qd17mRGA yapısı sistematik olarak aşağı regüle edilmiş olsa da, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP yapısıyla elde edilen floresan örüntülerini analiz edebildik (Ek Şekil 8g–j, l). Bu kontrol hattında, SAM'de floresan oranında yalnızca küçük değişiklikler tespit edildi, ancak SAM merkezinde TagBFP ile ilişkili VENUS'ta net ve beklenmedik bir azalma gözlemledik. Bu, qmRGA tarafından gözlemlenen sinyalleme örüntüsünün mRGA-VENUS'un GA'ya bağlı bozunmasını yansıttığını doğrular, ancak aynı zamanda qmRGA'nın meristem merkezindeki GA sinyalleme aktivitesini abartmış olabileceğini de gösterir. Özetle, sonuçlarımız öncelikle primordiaların dağılımını yansıtan bir GA sinyalleme örüntüsünü ortaya koymaktadır. Bu inter-primordial bölge (IPR) dağılımı, gelişmekte olan primordium ile merkezi bölge arasında yüksek GA sinyalleme aktivitesinin kademeli olarak kurulmasından kaynaklanırken, aynı zamanda primordiumdaki GA sinyalleme aktivitesi azalır (Şekil 4c, d).
GID1b ve GID1c reseptörlerinin dağılımı (yukarıya bakınız), GA reseptörlerinin farklı ekspresyonunun SAM'deki GA sinyal aktivitesinin örüntüsünü şekillendirmeye yardımcı olduğunu göstermektedir. GA'nın farklı birikiminin söz konusu olup olmadığını merak ettik. Bu olasılığı araştırmak için nlsGPS1 GA FRET sensörünü21 kullandık. 100 dakika boyunca 10 μM GA4+7 ile tedavi edilen nlsGPS1'in SAM'inde artmış aktivasyon frekansı tespit edildi (Ek Şekil 9a–e), bu da nlsGPS1'in SAM'deki GA konsantrasyonundaki değişikliklere, köklerde olduğu gibi yanıt verdiğini göstermektedir21. nlsGPS1 aktivasyon frekansının mekansal dağılımı, SAM'in dış katmanlarında nispeten düşük GA seviyeleri ortaya koydu, ancak bunların SAM'in merkezinde ve sınırlarında yükseldiğini gösterdi (Şekil 4e ve Ek Şekil 9a,c). Bu, GA'nın SAM'de qmRGA tarafından ortaya çıkarılana benzer bir mekansal desenle dağıldığını da göstermektedir. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, SAM'i floresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) veya negatif kontrol olarak tek başına Fl ile de tedavi ettik. Fl sinyali, daha düşük bir yoğunlukta olsa da, merkezi bölge ve primordium dahil olmak üzere SAM boyunca dağıldı (Şekil 4j ve Ek Şekil 10d). Buna karşılık, üç GA-Fl'nin hepsi, özellikle primordium sınırları içinde ve IPR'nin geri kalanında değişen derecelerde birikti, GA7-Fl, IPR'deki en büyük alanda birikti (Şekil 4k ve Ek Şekil 10a,b). Floresan yoğunluğunun kantifikasyonu, IPR/IPR olmayan yoğunluk oranının GA-Fl ile tedavi edilen SAM'de Fl ile tedavi edilen SAM'e kıyasla daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 4l ve Ek Şekil 10c). Bu sonuçlar bir arada, GA'nın organ sınırına en yakın bulunan IPR hücrelerinde daha yüksek konsantrasyonlarda bulunduğunu göstermektedir. Bu, SAM GA sinyal aktivitesi örüntüsünün hem GA reseptörlerinin farklı ifadesinden hem de organ sınırlarına yakın IPR hücrelerinde GA'nın farklı birikiminden kaynaklandığını göstermektedir. Bu nedenle, analizimiz GA sinyallemesinin beklenmedik bir uzaysal-zamansal örüntüsünü ortaya koydu; SAM'in merkezinde ve ilkelinde daha düşük aktivite ve periferik bölgedeki IPR'de daha yüksek aktivite vardı.
SAM'deki farklı GA sinyal aktivitesinin rolünü anlamak için, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS'nin gerçek zamanlı zaman atlamalı görüntülemesini kullanarak GA sinyal aktivitesi, hücre genişlemesi ve hücre bölünmesi arasındaki korelasyonu analiz ettik. GA'nın büyüme düzenlemesindeki rolü göz önüne alındığında, hücre genişleme parametreleriyle pozitif bir korelasyon bekleniyordu. Bu nedenle, önce GA sinyal aktivitesi haritalarını hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarıyla (belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için hücre genişlemesinin gücünün bir temsilcisi olarak) ve hücre genişlemesinin yönlülüğünü ölçen büyüme anizotropisi haritalarıyla (burada ayrıca belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için kullanılmıştır; Şekil 5a,b, Yöntemler ve Ek Yöntemlere bakın) karşılaştırdık. SAM hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarımız, sınırda minimum büyüme hızları ve gelişmekte olan çiçeklerde maksimum büyüme hızları ile önceki gözlemlerle38,39 tutarlıdır (Şekil 5a). Temel bileşen analizi (PCA), GA sinyalleme aktivitesinin hücre yüzeyi büyüme yoğunluğuyla negatif korelasyonlu olduğunu gösterdi (Şekil 5c). Ayrıca, GA sinyalleme girişi ve büyüme yoğunluğu dahil olmak üzere ana varyasyon eksenlerinin yüksek CLV3 ekspresyonu tarafından belirlenen yöne ortogonal olduğunu gösterdik ve bu da kalan analizlerde hücrelerin SAM merkezinden dışlandığını doğruladı. Spearman korelasyon analizi PCA sonuçlarını doğruladı (Şekil 5d), IPR'deki daha yüksek GA sinyallerinin daha yüksek hücre genişlemesiyle sonuçlanmadığını gösterdi. Ancak, korelasyon analizi GA sinyalleme aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasında hafif bir pozitif korelasyon olduğunu ortaya koydu (Şekil 5c, d), bu da IPR'deki daha yüksek GA sinyallemesinin hücre büyümesinin yönünü ve muhtemelen hücre bölünme düzleminin konumunu etkilediğini düşündürmektedir.
a, b Yedi bağımsız bitki üzerinde ortalaması alınan SAM'deki ortalama yüzey büyümesi (a) ve büyüme anizotropisinin (b) ısı haritaları (sırasıyla hücre genişlemesinin gücü ve yönü için vekil olarak kullanılmıştır). c PCA analizi şu değişkenleri içeriyordu: GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu, yüzey büyüme anizotropisi ve CLV3 ekspresyonu. PCA bileşeni 1, yüzey büyüme yoğunluğu ile esas olarak negatif korelasyonluydu ve GA sinyali ile pozitif korelasyonluydu. PCA bileşeni 2, yüzey büyüme anizotropisi ile esas olarak pozitif korelasyonluydu ve CLV3 ekspresyonu ile negatif korelasyonluydu. Yüzdeler, her bir bileşen tarafından açıklanan varyasyonu temsil eder. d CZ hariç doku ölçeğinde GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu ve yüzey büyüme anizotropisi arasındaki Spearman korelasyon analizi. Sağdaki sayı, iki değişken arasındaki Spearman rho değeridir. Yıldız işaretleri, korelasyon/negatif korelasyonun oldukça önemli olduğu durumları göstermektedir. e Konfokal mikroskopi ile Col-0 SAM L1 hücrelerinin 3B görselleştirilmesi. SAM'de (ancak primordiumda değil) 10 saatte oluşan yeni hücre duvarları açı değerlerine göre renklendirilir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilir. Ek parça 0 saatteki ilgili 3B görüntüyü gösterir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. f Kutu grafikleri IPR ve IPR olmayan Col-0 SAM'deki hücre bölünme oranlarını gösterir (n = 10 bağımsız bitki). Ortadaki çizgi medyanı gösterir ve kutu sınırları 25. ve 75. persentilleri gösterir. Bıyıklar R yazılımı ile belirlenen minimum ve maksimum değerleri gösterir. P değerleri Welch'in iki kuyruklu t-testi ile elde edildi. g, h (g) Yeni hücre duvarının (macenta) SAM'ın merkezinden (beyaz noktalı çizgi) radyal yöne göre açısının nasıl ölçüleceğini (sadece dar açı değerleri, yani 0–90° dikkate alınır) ve (h) meristem içindeki çevresel/yanal ve radyal yönleri gösteren şematik diyagram. i Sırasıyla SAM (koyu mavi), IPR (orta mavi) ve IPR dışı (açık mavi) boyunca hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edildi. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. j Sırasıyla P3 (açık yeşil), P4 (orta yeşil) ve P5 (koyu yeşil) etrafındaki IPR'nin hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edildi. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı.
Bu nedenle, daha sonra deney sırasında yeni oluşan hücre duvarlarını tanımlayarak GA sinyallemesi ile hücre bölünme aktivitesi arasındaki ilişkiyi araştırdık (Şekil 5e). Bu yaklaşım, hücre bölünmesinin sıklığını ve yönünü ölçmemize olanak sağladı. Şaşırtıcı bir şekilde, IPR'deki ve SAM'ın geri kalanındaki (IPR olmayan, Şekil 5f) hücre bölünmelerinin sıklığının benzer olduğunu bulduk; bu, IPR ve IPR olmayan hücreler arasındaki GA sinyallemesindeki farklılıkların hücre bölünmesini önemli ölçüde etkilemediğini gösteriyor. Bu ve GA sinyallemesi ile büyüme anizotropisi arasındaki pozitif ilişki, GA sinyallemesi aktivitesinin hücre bölünme düzleminin yönelimini etkileyip etkilemediğini düşünmemize yol açtı. Yeni hücre duvarının yönelimini, meristem merkezini ve yeni hücre duvarının merkezini birleştiren radyal eksene göre dar açı olarak ölçtük (Şekil 5e-i) ve hücrelerin radyal eksene göre 90°'ye yakın açılarda bölünmeye yönelik açık bir eğilim gözlemledik, en yüksek frekanslar 70–80° (%23,28) ve 80–90° (%22,62) açılarda gözlendi (Şekil 5e,i), bu da çevresel/enine yöndeki hücre bölünmelerine karşılık geliyor (Şekil 5h). GA sinyallemesinin bu hücre bölünme davranışına katkısını incelemek için, IPR ve IPR olmayan hücre bölünme parametrelerini ayrı ayrı analiz ettik (Şekil 5i). IPR hücrelerindeki bölünme açısı dağılımının, IPR olmayan hücrelerdeki veya tüm SAM'deki hücrelerdeki dağılımdan farklı olduğunu, IPR hücrelerinin daha yüksek oranda yanal/dairesel hücre bölünmesi, yani 70–80° ve 80–90° (sırasıyla %33,86 ve %30,71, karşılık gelen oranlar) sergilediğini gözlemledik (Şekil 5i). Bu nedenle, gözlemlerimiz yüksek GA sinyallemesi ile çevresel yöne yakın bir hücre bölünme düzlemi yönelimi arasında, GA sinyalleme aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasındaki korelasyona benzer bir ilişki ortaya koydu (Şekil 5c, d). Bu ilişkinin mekansal korunumunu daha da belirlemek için, en yüksek GA sinyalleme aktivitesinin P4'ten başlayarak bu bölgede tespit edilmesi nedeniyle, P3'ten başlayarak primordiyumu çevreleyen IPR hücrelerinde bölünme düzlemi yönelimini ölçtük (Şekil 4). P3 ve P4 civarındaki IPR'nin bölünme açıları istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermedi, ancak P4 civarındaki IPR'de lateral hücre bölünmelerinin artan sıklığı gözlendi (Şekil 5j). Ancak, P5 civarındaki IPR hücrelerinde, hücre bölünme düzleminin yönelimindeki fark istatistiksel olarak anlamlı hale geldi ve transvers hücre bölünmelerinin sıklığında keskin bir artış oldu (Şekil 5j). Bu sonuçlar bir araya geldiğinde, GA sinyallemesinin SAM'deki hücre bölünmelerinin yönelimini kontrol edebileceğini ve bunun da yüksek GA sinyallemesinin IPR'de hücre bölünmelerinin lateral yönelimini indükleyebileceğine dair önceki raporlarla40,41 tutarlı olduğunu göstermektedir.
IPR'deki hücrelerin primordialara değil, internodlara dahil edileceği öngörülmektedir2,42,43. IPR'deki hücre bölünmelerinin enine yönelimi, internodlarda tipik olarak paralel uzunlamasına epidermal hücre sıralarının organizasyonuyla sonuçlanabilir. Yukarıda açıklanan gözlemlerimiz, GA sinyallemesinin hücre bölünmesinin yönünü düzenleyerek bu süreçte muhtemelen bir rol oynadığını göstermektedir.
Birkaç DELLA geninin fonksiyon kaybı, yapısal bir GA tepkisine yol açar ve bu hipotezi test etmek için della mutantları kullanılabilir44. İlk olarak SAM'deki beş DELLA geninin ifade modellerini analiz ettik. GUS hattının45 transkripsiyonel füzyonu, GAI, RGA, RGL1 ve RGL2'nin (çok daha az bir ölçüde) SAM'de ifade edildiğini ortaya koydu (Ek Şekil 11a–d). Yerinde hibridizasyon ayrıca GAI mRNA'sının özellikle primordialarda ve gelişen çiçeklerde biriktiğini gösterdi (Ek Şekil 11e). RGL1 ve RGL3 mRNA, SAM kanopisi boyunca ve daha yaşlı çiçeklerde tespit edildi, buna karşın RGL2 mRNA sınır bölgesinde daha bol miktardaydı (Ek Şekil 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM'in konfokal görüntülemesi, in situ hibridizasyonla gözlemlenen ifadeyi doğruladı ve RGL3 proteininin SAM'in merkezi kısmında biriktiğini gösterdi (Ek Şekil 11i). pRGA::GFP-RGA hattını kullanarak, RGA proteininin SAM'de biriktiğini, ancak bolluğunun P4'ten başlayarak sınırda azaldığını da bulduk (Ek Şekil 11j). Özellikle, RGL3 ve RGA'nın ifade kalıpları, qmRGA tarafından tespit edildiği gibi, IPR'de daha yüksek GA sinyal aktivitesiyle tutarlıdır (Şekil 4). Dahası, bu veriler tüm DELLA'ların SAM'de ifade edildiğini ve ifadelerinin toplu olarak tüm SAM'i kapsadığını göstermektedir.
Daha sonra hücre bölünme parametrelerini vahşi tip SAM'de (Ler, kontrol) ve gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beşli (global) mutantlarında analiz ettik (Şekil 6a, b). İlginç bir şekilde, della global mutant SAM'de hücre bölünme açısı frekanslarının dağılımında vahşi tipe kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir kayma gözlemledik (Şekil 6c). Della global mutantındaki bu değişim, 80–90° açıların sıklığındaki artıştan (34,71% - %24,55) ve daha az ölçüde 70–80° açıların sıklığındaki artıştan (23,78% - %20,18) kaynaklanıyordu, yani enine hücre bölünmelerine karşılık geliyordu (Şekil 6c). Enine olmayan bölünmelerin sıklığı (0–60°) de della global mutantında daha düşüktü (Şekil 6c). Enine hücre bölünmelerinin sıklığı della global mutantının SAM'ında önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6b). IPR'deki enine hücre bölünmelerinin sıklığı della global mutantında vahşi tipe kıyasla daha yüksekti (Şekil 6d). IPR bölgesinin dışında, vahşi tip hücre bölünme açılarının daha düzgün bir dağılımına sahipken, della global mutantı IPR gibi teğetsel bölünmeleri tercih etti (Şekil 6e). Ayrıca, GA'nın biriktiği GA-inaktif mutant arka planı olan ga2 oksidaz (ga2ox) beşli mutantlarının (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ve ga2ox6-2) SAM'ındaki hücre bölünmelerinin yönelimini de ölçtük. GA seviyelerindeki artışla tutarlı olarak, beşli ga2ox mutant çiçeklenmesinin SAM'ı Col-0'ınkinden daha büyüktü (Ek Şekil 12a, b) ve Col-0 ile karşılaştırıldığında, beşli ga2ox SAM hücre bölünme açılarının belirgin şekilde farklı bir dağılımını gösterdi, açı frekansı 50°'den 90°'ye çıktı, yani yine teğetsel bölünmeleri destekledi (Ek Şekil 12a–c). Bu nedenle, GA sinyallemesinin ve GA birikiminin yapısal aktivasyonunun IPR'de ve SAM'ın geri kalanında yanal hücre bölünmelerini indüklediğini gösteriyoruz.
a, b PI boyalı Ler (a) ve global della mutantı (b) SAM'in L1 tabakasının konfokal mikroskopi kullanılarak 3B görselleştirilmesi. SAM'de (ancak primordiumda değil) 10 saatlik bir süre boyunca oluşan yeni hücre duvarları gösterilmiş ve açı değerlerine göre renklendirilmiştir. Ek parça 0. saatteki SAM'i göstermektedir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilmiştir. (b)'deki ok, global della mutantındaki hizalanmış hücre dosyalarına bir örnek göstermektedir. Deney iki kez tekrarlanmış ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. ce Ler ve global della arasındaki tüm SAM (d), IPR (e) ve IPR olmayan (f) hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımının karşılaştırılması. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edilmiştir. f, g Col-0 (i) ve pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenik bitkilerinin PI boyalı SAM'inin konfokal görüntülerinin 3B görselleştirilmesi. Paneller (a, b) SAM'de 10 saat içinde oluşan yeni hücre duvarlarını (ancak primordiaları değil) göstermektedir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlanmıştır. h–j Col-0 ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkileri arasında tüm SAM'de (h), IPR'de (i) ve IPR olmayan (j) hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımının karşılaştırılması. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edilmiştir.
Daha sonra GA sinyallemesini özellikle IPR'de inhibe etmenin etkisini test ettik. Bu amaçla, baskın negatif gai-1 proteininin VENUS'a kaynaştırılmasının ifadesini yönlendirmek için kotiledon kupası 2 (CUC2) promotörünü kullandık (pCUC2::gai-1-VENUS hattında). Vahşi tip SAM'de, CUC2 promotörü, P4'ten itibaren sınır hücreleri de dahil olmak üzere SAM'deki çoğu IPR'nin ifadesini yönlendirir ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde benzer spesifik ifade gözlemlendi (aşağıya bakın). pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinin SAM veya IPR'si boyunca hücre bölünme açılarının dağılımı, vahşi tiptekinden önemli ölçüde farklı değildi, ancak beklenmedik bir şekilde bu bitkilerde IPR'si olmayan hücrelerin 80–90°'lik daha yüksek bir frekansta bölündüğünü bulduk (Şekil 6f–j).
Hücre bölünmesinin yönünün SAM'ın geometrisine, özellikle de doku eğriliği tarafından oluşturulan çekme gerilimine bağlı olduğu öne sürülmüştür46. Bu nedenle SAM'ın şeklinin della global mutant ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde değişip değişmediğini sorduk. Daha önce bildirildiği gibi12, della global mutant SAM'ın boyutu vahşi tipten daha büyüktü (Ek Şekil 13a, b, d). CLV3 ve STM RNA'nın yerinde hibridizasyonu, della mutantlarındaki meristem genişlemesini doğruladı ve ayrıca kök hücre nişinin yanal genişlemesini gösterdi (Ek Şekil 13e, f, h, i). Ancak, SAM eğriliği her iki genotipte de benzerdi (Ek Şekil 13k, m, n, p). Vahşi tiple karşılaştırıldığında eğrilikte bir değişiklik olmaksızın gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dörtlü mutantında benzer bir boyut artışı gözlemledik (Ek Şekil 13c, d, g, j, l, o, p). Hücre bölünme yöneliminin sıklığı da della dörtlü mutantında etkilendi, ancak della monolitik mutantındakinden daha az ölçüde (Ek Şekil 12d–f). Bu dozaj etkisi, eğrilik üzerinde bir etkinin olmamasıyla birlikte, Della dörtlü mutantındaki artık RGL3 aktivitesinin, DELLA aktivitesinin kaybından kaynaklanan hücre bölünme yönelimindeki değişiklikleri sınırladığını ve yanal hücre bölünmelerindeki değişikliklerin SAM geometrisindeki değişikliklerden ziyade GA sinyalleme aktivitesindeki değişikliklere yanıt olarak meydana geldiğini düşündürmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, CUC2 promotörü P4'ten başlayarak SAM'deki IPR ekspresyonunu yönlendirir (Ek Şekil 14a, b) ve bunun aksine, pCUC2::gai-1-VENUS SAM küçültülmüş bir boyuta ancak daha yüksek bir eğriliğe sahipti (Ek Şekil 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki bu değişiklik, yüksek çevresel streslerin SAM merkezinden daha kısa bir mesafede başladığı vahşi tipe kıyasla farklı bir mekanik stres dağılımına neden olabilir47. Alternatif olarak, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki değişiklikler, transgen ekspresyonu tarafından indüklenen bölgesel mekanik özelliklerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir48. Her iki durumda da, bu, hücrelerin çevresel/enine yönelimde bölünme olasılığını artırarak GA sinyallemesindeki değişikliklerin etkilerini kısmen telafi edebilir ve gözlemlerimizi açıklayabilir.
Birlikte ele alındığında, verilerimiz daha yüksek GA sinyallemesinin IPR'deki hücre bölünme düzleminin lateral yöneliminde aktif bir rol oynadığını doğrulamaktadır. Ayrıca meristem eğriliğinin IPR'deki hücre bölünme düzleminin yönelimini de etkilediğini göstermektedir.
Yüksek GA sinyalleme aktivitesi nedeniyle IPR'deki bölünme düzleminin enine yönelimi, GA'nın SAM içindeki epidermiste radyal bir hücre dosyasını önceden organize ettiğini ve daha sonra epidermal internodda bulunacak hücresel organizasyonu tanımladığını düşündürmektedir. Gerçekten de, bu tür hücre dosyaları sıklıkla della global mutantlarının SAM görüntülerinde görülmekteydi (Şekil 6b). Bu nedenle, SAM'deki GA sinyallemesinin mekansal örüntüsünün gelişimsel işlevini daha fazla araştırmak için, vahşi tip (Ler ve Col-0), della global mutantları ve pCUC2::gai-1-VENUS transgenik bitkilerinde IPR'deki hücrelerin mekansal organizasyonunu analiz etmek için zaman aralıklı görüntüleme kullandık.
qmRGA'nın IPR'deki GA sinyalleme aktivitesinin P1/P2'den arttığını ve P4'te zirveye ulaştığını ve bu desenin zaman içinde sabit kaldığını gösterdiğini bulduk (Şekil 4a–f ve Ek Şekil 8c–f, k). Artan GA sinyaliyle IPR'deki hücrelerin mekansal organizasyonunu analiz etmek için, Ler IPR hücrelerini ilk gözlemden 34 saat sonra analiz edilen gelişimsel kaderlerine göre P4'ün üstünde ve yanlarında etiketledik, yani iki plastid zamanından daha uzun bir süre, bu da IPR hücrelerini P1/P2'den P4'e kadar primordiyum gelişimi sırasında takip etmemize olanak sağladı. Üç farklı renk kullandık: P4 yakınındaki primordiyuma entegre olan hücreler için sarı, IPR'de olanlar için yeşil ve her iki işleme de katılanlar için mor (Şekil 7a–c). t0'da (0 saat), P4'ün önünde 1–2 kat IPR hücresi görüldü (Şekil 7a). Beklendiği gibi, bu hücreler bölündüğünde, bunu esas olarak enine bölünme düzlemi üzerinden yaptılar (Şekil 7a–c). Benzer sonuçlar Col-0 SAM kullanılarak elde edildi (sınırı Ler'deki P4'e benzer şekilde katlanan P3'e odaklanarak), ancak bu genotipte floral sınırda oluşan kat IPR hücrelerini daha hızlı gizledi (Şekil 7g–i). Bu nedenle, IPR hücrelerinin bölünme örüntüsü hücreleri internodlardaki gibi radyal sıralara önceden düzenler. Radyal sıraların organizasyonu ve IPR hücrelerinin ardışık organlar arasındaki lokalizasyonu, bu hücrelerin internodal progenitörler olduğunu düşündürmektedir.
Burada, birleşik GA ve GA reseptör konsantrasyonlarından kaynaklanan GA sinyal aktivitesinin kantitatif haritalanmasına izin veren ve endojen sinyal yollarıyla etkileşimi en aza indiren, böylece hücresel düzeyde GA işlevi hakkında bilgi sağlayan oranlı bir GA sinyal biyosensörü olan qmRGA'yı geliştirdik. Bu amaçla, DELLA etkileşim ortaklarına bağlanma yeteneğini kaybetmiş ancak GA kaynaklı proteolize duyarlı kalan modifiye edilmiş bir DELLA proteini olan mRGA'yı oluşturduk. qmRGA, GA seviyelerindeki hem ekzojen hem de endojen değişikliklere yanıt verir ve dinamik algılama özellikleri, gelişim sırasında GA sinyal aktivitesindeki uzaysal ve zamansal değişikliklerin değerlendirilmesini sağlar. qmRGA ayrıca, ifadesi için kullanılan promotörü değiştirerek (gerekirse) farklı dokulara uyarlanabildiği için çok esnek bir araçtır ve GA sinyal yolunun ve anjiyospermler boyunca PFYRE motifinin korunan doğası göz önüne alındığında, diğer türlere aktarılabilir olması muhtemeldir22. Bununla tutarlı olarak, pirinç SLR1 DELLA proteinindeki (HYY497AAA) eşdeğer bir mutasyonun da SLR1'in büyüme baskılayıcı aktivitesini baskıladığı, ancak mRGA23'e benzer şekilde GA aracılı bozunmasını yalnızca hafifçe azalttığı gösterildi. Özellikle, Arabidopsis'teki son çalışmalar, PFYRE alanındaki (S474L) tek bir amino asit mutasyonunun, transkripsiyon faktörü ortaklarıyla etkileşime girme yeteneğini etkilemeden RGA'nın transkripsiyonel aktivitesini değiştirdiğini gösterdi50. Bu mutasyon mRGA'da bulunan 3 amino asit ikamesine çok yakın olmasına rağmen, çalışmalarımız bu iki mutasyonun DELLA'nın farklı özelliklerini değiştirdiğini göstermektedir. Çoğu transkripsiyon faktörü ortağı DELLA'nın LHR1 ve SAW alanlarına bağlansa da26,51, PFYRE alanındaki bazı korunan amino asitler bu etkileşimleri stabilize etmeye yardımcı olabilir.
Düğüm arası gelişim, bitki mimarisinde ve verim artışında önemli bir özelliktir. qmRGA, IPR düğüm arası progenitör hücrelerinde daha yüksek GA sinyal aktivitesi ortaya koydu. Kantitatif görüntüleme ve genetiği birleştirerek, GA sinyal örüntülerinin SAM epidermisinde dairesel/enine hücre bölünme düzlemlerini üst üste bindirdiğini ve düğüm arası gelişim için gereken hücre bölünme organizasyonunu şekillendirdiğini gösterdik. Gelişim sırasında hücre bölünme düzlemi yöneliminin birkaç düzenleyicisi tanımlanmıştır52,53. Çalışmamız, GA sinyal aktivitesinin bu hücresel parametreyi nasıl düzenlediğine dair net bir örnek sunmaktadır. DELLA, ön katlama protein kompleksleriyle etkileşime girebilir41, bu nedenle GA sinyallemesi, doğrudan kortikal mikrotübül yönelimini etkileyerek hücre bölünme düzlemi yönelimini düzenleyebilir40,41,54,55. Beklenmedik bir şekilde, SAM'de daha yüksek GA sinyal aktivitesinin korelasyonunun hücre uzaması veya bölünmesi değil, yalnızca büyüme anizotropisi olduğunu gösterdik; bu, GA'nın IPR'de hücre bölünme yönü üzerindeki doğrudan etkisiyle tutarlıdır. Ancak, bu etkinin dolaylı da olabileceğini, örneğin GA ile indüklenen hücre duvarı yumuşaması56 ile aracılık edilebileceğini göz ardı edemeyiz. Hücre duvarı özelliklerindeki değişiklikler mekanik strese neden olur57,58, bu da kortikal mikrotübüllerin yönelimini etkileyerek hücre bölünme düzleminin yönelimini etkileyebilir39,46,59. GA ile indüklenen mekanik stresin ve GA tarafından mikrotübül yöneliminin doğrudan düzenlenmesinin birleşik etkileri, internodları tanımlamak için IPR'de belirli bir hücre bölünme yönelimi örüntüsü oluşturmada rol oynayabilir ve bu fikri test etmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, önceki çalışmalar internod oluşumunun kontrolünde DELLA ile etkileşen TCP14 ve 15 proteinlerinin önemini vurgulamıştır60,61 ve bu faktörler GA'nın internod gelişimini düzenleyen ve GA sinyallemesini etkilediği gösterilen BREVIPEDICELLUS (BP) ve PENNYWISE (PNY) ile birlikte etkisini aracılık edebilir2,62. DELLA'ların brassinosteroid, etilen, jasmonik asit ve absisik asit (ABA) sinyal yollarıyla etkileşime girdiği63,64 ve bu hormonların mikrotübül yönelimini etkileyebildiği65 göz önüne alındığında, GA'nın hücre bölünme yönelimi üzerindeki etkileri diğer hormonlar tarafından da aracılık edilebilir.
Erken sitolojik çalışmalar, Arabidopsis SAM'ın hem iç hem de dış bölgelerinin internod gelişimi için gerekli olduğunu gösterdi2,42. GA'nın iç dokularda hücre bölünmesini aktif olarak düzenlemesi12, GA'nın SAM'daki meristem ve internod boyutunu düzenlemede ikili bir işlevi olduğunu destekler. Yönlendirilmiş hücre bölünmesinin örüntüsü de iç SAM dokusunda sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu düzenleme kök büyümesi için önemlidir52. GA'nın ayrıca iç SAM organizasyonunda hücre bölünme düzlemini yönlendirmede bir rol oynayıp oynamadığını ve böylece SAM içindeki internodların belirlenmesini ve gelişimini senkronize edip etmediğini incelemek ilginç olacaktır.
Bitkiler, %1 sakaroz ve %1 agar (Sigma) ile desteklenmiş toprakta veya 1x Murashige-Skoog (MS) besiyerinde (Duchefa) standart koşullar altında (16 saat ışık, 22 °C) in vitro yetiştirildi; fidelerin sabit ışık ve 22 °C'de dikey plakalarda yetiştirildiği hipokotil ve kök büyüme deneyleri hariç. Nitrat deneyleri için, bitkiler uzun gün koşulları altında yeterli nitrat (0 veya 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-süksinat, %1 sakaroz ve %1 A-agar (Sigma) ile desteklenmiş modifiye MS besiyerinde (bioWORLD bitki besiyeri) yetiştirildi.
pDONR221'e eklenen GID1a cDNA'sı, pB7m34GW'ye pDONR P4-P1R-pUBQ10 ve pDONR P2R-P3-mCherry ile yeniden birleştirilerek pUBQ10::GID1a-mCherry oluşturuldu. pDONR221'e eklenen IDD2 DNA'sı, p35S:IDD2-RFP oluşturmak için pB7RWG266'ya yeniden birleştirildi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b'yi üretmek için, GID1b kodlama bölgesinin yukarısında 3,9 kb'lik bir parça ve GID1b cDNA'sını (1,3 kb) ve sonlandırıcıyı (3,4 kb) içeren 4,7 kb'lik bir parça ilk önce Ek Tablo 3'teki primerler kullanılarak çoğaltıldı ve ardından sırasıyla pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ve pDONR P2R-P3'e (Thermo Fisher Scientific) yerleştirildi ve son olarak Gateway klonlama kullanılarak pGreen 012567 hedef vektörüne pDONR221 2xmTQ268 ile rekombinasyon yapıldı. pCUC2::LSSmOrange'ı üretmek için, büyük Stokes-kaydırılmış mOrange (LSSmOrange)69'un kodlama dizisinin (ATG'den 3229 bp yukarı akış) ardından N7 nükleer lokalizasyon sinyali ve NOS transkripsiyonel sonlandırıcısı ile CUC2 promotör dizisi, Gateway 3-fragman rekombinasyon sistemi (Invitrogen) kullanılarak pGreen kanamisin hedefleme vektörüne birleştirildi. Bitki ikili vektörü Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101'e sokuldu ve sırasıyla Agrobacterium infiltrasyon yöntemi ile Nicotiana benthamiana yapraklarına ve çiçek daldırma yöntemi ile Arabidopsis thaliana Col-0'a sokuldu. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ve pCLV3::mCherry-NLS qmRGA, sırasıyla ilgili çaprazlamaların F3 ve F1 yavrularından izole edildi.
Yaklaşık 1 cm uzunluğundaki sürgün uçlarında RNA in situ hibridizasyonu gerçekleştirildi72, bunlar toplandı ve hemen 4 °C'ye önceden soğutulmuş FAA çözeltisinde (3,7% formaldehit, 5% asetik asit, 50% etanol) sabitlendi. 2 × 15 dakikalık vakum işlemlerinden sonra, sabitleyici değiştirildi ve örnekler bir gece inkübe edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ve RGL3 cDNA'ları ve 3'-UTR'lerine yönelik antisens probları, Rosier ve ark. tarafından açıklandığı gibi Ek Tablo 3'te gösterilen primerler kullanılarak sentezlendi73. Digoksigenin işaretli problar, digoksigenin antikorları (3000 kat seyreltme; Roche, katalog numarası: 11 093 274 910) kullanılarak immünolojik olarak tespit edildi ve kesitler 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, 250 kat seyreltme)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 kat seyreltme) solüsyonu ile boyandı.
Gönderi zamanı: 10-Şub-2025