Sürgün apikal meristeminin (SAM) büyümesi, gövde mimarisi için kritik öneme sahiptir. Bitki hormonlarıgibberellinler(GA'lar) bitki büyümesinin koordinasyonunda önemli roller oynar, ancak SAM'deki rolleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, DELLA proteinini, GA transkripsiyonel yanıtındaki temel düzenleyici işlevini bastırırken GA tanınması üzerine bozunmasını koruyacak şekilde tasarlayarak GA sinyallemesinin oransal bir biyosensörü geliştirdik. Bu bozunmaya dayalı biyosensörün, gelişim sırasında GA seviyelerindeki ve hücresel algılamadaki değişiklikleri doğru bir şekilde kaydettiğini gösterdik. Bu biyosensörü, SAM'deki GA sinyalleme aktivitesini haritalamak için kullandık. Yüksek GA sinyallerinin, internod hücrelerinin öncüleri olan organ primordiaları arasında yer alan hücrelerde baskın olarak bulunduğunu gösterdik. İşlev kazanımı ve kaybı yaklaşımlarını kullanarak, GA'nın hücre bölünme düzleminin yönelimini düzenlediğini, internodların kanonik hücresel organizasyonunu oluşturduğunu ve böylece SAM'de internod spesifikasyonunu desteklediğini daha da gösterdik.
Sürgün tepesinde bulunan sürgün apikal meristemi (SAM), bitkinin ömrü boyunca modüler ve yinelemeli bir şekilde yanal organlar ve gövde düğümleri oluşturan bir kök hücre nişi içerir. Bu tekrarlayan birimlerin veya bitki düğümlerinin her biri, düğümlerdeki internodları ve yanal organları ve yaprak koltuklarındaki aksiller meristemleri içerir1. Bitki düğümlerinin büyümesi ve organizasyonu gelişim sırasında değişir. Arabidopsis'te, vejetatif aşamada internodal büyüme baskılanır ve rozet yapraklarının koltuklarında aksiller meristemler uykuda kalır. Çiçeklenme evresine geçiş sırasında SAM, çiçek salkımı meristemine dönüşerek uzun internodlar ve koltuk tomurcukları, gövde yapraklarının koltuklarındaki dalcıklar ve daha sonra yapraksız çiçekler üretir2. Yaprakların, çiçeklerin ve dalların oluşumunu kontrol eden mekanizmaları anlamada önemli ilerleme kaydetmiş olsak da, internodların nasıl ortaya çıktığı hakkında nispeten az şey bilinmektedir.
GA'ların zamansal ve mekânsal dağılımını anlamak, bu hormonların farklı dokulardaki ve farklı gelişim evrelerindeki işlevlerini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Kendi promotörünün etkisi altında ifade edilen RGA-GFP füzyonunun bozunmasının görselleştirilmesi, köklerdeki toplam GA seviyelerinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlar15,16. Ancak, RGA ekspresyonu dokular arasında değişiklik gösterir17 ve GA18 tarafından düzenlenir. Bu nedenle, RGA promotörünün farklı ekspresyonu, RGA-GFP ile gözlenen floresan desenine neden olabilir ve bu nedenle bu yöntem kantitatif değildir. Daha yakın zamanlarda, biyoaktif floresin (Fl) etiketli GA19,20, kök endokorteksinde GA birikimini ve hücresel seviyelerinin GA taşınmasıyla düzenlenmesini ortaya koymuştur. Son zamanlarda, GA FRET sensörü nlsGPS1, GA seviyelerinin köklerde, filamentlerde ve karanlıkta büyüyen hipokotillerde hücre uzamasıyla ilişkili olduğunu göstermiştir21. Ancak, gördüğümüz gibi, GA konsantrasyonu, karmaşık algılama süreçlerine bağlı olduğundan, GA sinyalleme aktivitesini kontrol eden tek parametre değildir. Burada, DELLA ve GA sinyalleme yollarına ilişkin anlayışımıza dayanarak, GA sinyallemesi için bozunmaya dayalı bir oransal metrik biyosensörün geliştirilmesini ve karakterizasyonunu bildiriyoruz. Bu kantitatif biyosensörü geliştirmek için, floresan bir proteine kaynaştırılmış ve dokularda yaygın olarak ifade edilen mutant bir GA-duyarlı RGA ile GA-duyarsız bir floresan protein kullandık. Mutant RGA protein füzyonlarının, yaygın olarak ifade edildiğinde endojen GA sinyallemesine müdahale etmediğini ve bu biyosensörün hem GA girdisinden hem de algılama cihazı tarafından GA sinyal işlenmesinden kaynaklanan sinyalleme aktivitesini yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükle ölçebildiğini gösteriyoruz. Bu biyosensörü, GA sinyalleme aktivitesinin uzaysal-zamansal dağılımını haritalamak ve GA'nın SAM epidermisinde hücresel davranışı nasıl düzenlediğini ölçmek için kullandık. GA'nın organ primordiaları arasında yer alan SAM hücrelerinin bölünme düzleminin yönelimini düzenlediğini ve böylece internodun kanonik hücresel organizasyonunu tanımladığını gösteriyoruz.
Son olarak, qmRGA'nın büyüyen hipokotilleri kullanarak endojen GA seviyelerindeki değişiklikleri raporlayıp raporlayamayacağını sorduk. Daha önce nitratın GA sentezini ve dolayısıyla DELLA34 bozunmasını artırarak büyümeyi uyardığını göstermiştik. Buna göre, bol nitrat kaynağı (10 mM NO3−) altında yetiştirilen pUBQ10::qmRGA fidelerindeki hipokotil uzunluğunun nitrat eksikliği olan koşullar altında yetiştirilen fidelere göre önemli ölçüde daha uzun olduğunu gözlemledik (Ek Şekil 6a). Büyüme tepkisiyle tutarlı olarak, GA sinyalleri 10 mM NO3− koşulları altında yetiştirilen fidelerin hipokotillerinde nitrat yokluğunda yetiştirilen fidelere göre daha yüksekti (Ek Şekil 6b, c). Bu nedenle, qmRGA ayrıca GA konsantrasyonundaki endojen değişikliklerin neden olduğu GA sinyallemesindeki değişikliklerin izlenmesini de sağlar.
qmRGA tarafından tespit edilen GA sinyal aktivitesinin, sensör tasarımına göre beklendiği gibi, GA konsantrasyonuna ve GA algısına bağlı olup olmadığını anlamak için, vejetatif ve üreme dokularındaki üç GID1 reseptörünün ifadesini analiz ettik. Fidelerde, GID1-GUS muhabir hattı, GID1a ve c'nin kotiledonlarda yüksek oranda ifade edildiğini gösterdi (Şekil 3a–c). Ayrıca, üç reseptörün tamamı yapraklarda, yan kök taslaklarında, kök uçlarında (GID1b'nin kök başlığı hariç) ve vasküler sistemde ifade edildi (Şekil 3a–c). Çiçeklenme SAM'inde, yalnızca GID1b ve 1c için GUS sinyalleri tespit ettik (Ek Şekil 7a–c). Yerinde hibridizasyon bu ifade modellerini doğruladı ve ayrıca GID1c'nin SAM'de düşük seviyelerde düzgün bir şekilde ifade edildiğini, GID1b'nin ise SAM'in çevresinde daha yüksek ifade gösterdiğini gösterdi (Ek Şekil 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasyonel füzyonu, SAM merkezinde düşük veya hiç ekspresyon olmamasından organ sınırlarında yüksek ekspresyona kadar kademeli bir GID1b ekspresyon aralığı da ortaya koydu (Ek Şekil 7m). Dolayısıyla, GID1 reseptörleri dokular arasında ve dokular içinde eşit olarak dağılmamıştır. Sonraki deneylerde, GID1'in (pUBQ10::GID1a-mCherry) aşırı ekspresyonunun, hipokotillerdeki qmRGA'nın harici GA uygulamasına duyarlılığını artırdığını da gözlemledik (Şekil 3d, e). Buna karşılık, hipokotilde qd17mRGA ile ölçülen floresans, GA3 uygulamasına duyarsızdı (Şekil 3f, g). Her iki deneyde de, sensörün GID1 reseptörüne bağlanma yeteneğinin arttığı veya kaybolduğu hızlı davranışını değerlendirmek için fideler yüksek konsantrasyonlarda GA (100 μM GA3) ile muamele edildi. Bu sonuçlar bir arada değerlendirildiğinde, qmRGA biyosensörünün GA ve GA sensörü olarak kombine bir işlev gördüğünü teyit etmekte ve GID1 reseptörünün farklı ekspresyonunun sensörün emisivitesini önemli ölçüde değiştirebileceğini ileri sürmektedir.
Bugüne kadar, GA sinyallerinin SAM'deki dağılımı belirsizliğini korumuştur. Bu nedenle, GA sinyal aktivitesinin yüksek çözünürlüklü kantitatif haritalarını hesaplamak için qmRGA eksprese eden bitkiler ve pCLV3::mCherry-NLS kök hücre raporlayıcısını35 kullandık ve L1 katmanına (epidermis; Şekil 4a, b, Yöntemler ve Ek Yöntemler'e bakın) odaklandık, çünkü L1, SAM büyümesinin kontrolünde önemli bir rol oynar36. Burada, pCLV3::mCherry-NLS ekspresyonu, GA sinyal aktivitesinin uzaysal ve zamansal dağılımını analiz etmek için sabit bir geometrik referans noktası sağladı37. GA, lateral organ gelişimi için gerekli kabul edilse de4, çiçek taslağında (P) GA sinyallerinin P3 aşamasından itibaren düşük olduğunu (Şekil 4a, b), genç P1 ve P2 taslağının ise merkezi bölgedekine benzer orta düzeyde aktiviteye sahip olduğunu gözlemledik (Şekil 4a, b). Organ primordium sınırlarında, P1/P2'den (sınırın kenarlarında) başlayıp P4'te zirveye ulaşan ve primordialar arasında yer alan periferik bölgenin tüm hücrelerinde daha yüksek GA sinyal aktivitesi tespit edildi (Şekil 4a, b ve Ek Şekil 8a, b). Bu daha yüksek GA sinyal aktivitesi yalnızca epidermiste değil, aynı zamanda L2 ve üst L3 katmanlarında da gözlendi (Ek Şekil 8b). qmRGA kullanılarak SAM'de tespit edilen GA sinyallerinin örüntüsü de zamanla değişmeden kaldı (Ek Şekil 8c–f, k). Ayrıntılı olarak karakterize ettiğimiz beş bağımsız hattan T3 bitkilerinin SAM'sinde qd17mRGA yapısı sistematik olarak aşağı regüle edilmiş olsa da, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP yapısıyla elde edilen floresan örüntülerini analiz edebildik (Ek Şekil 8g–j, l). Bu kontrol hattında, SAM'de floresan oranında yalnızca küçük değişiklikler tespit edildi, ancak SAM merkezinde TagBFP ile ilişkili VENUS'ta belirgin ve beklenmedik bir azalma gözlemledik. Bu, qmRGA tarafından gözlemlenen sinyalleme örüntüsünün mRGA-VENUS'un GA'ya bağlı bozunmasını yansıttığını doğrular, ancak aynı zamanda qmRGA'nın meristem merkezindeki GA sinyalleme aktivitesini abartabileceğini de gösterir. Özetle, sonuçlarımız öncelikle primordiaların dağılımını yansıtan bir GA sinyalleme örüntüsünü ortaya koymaktadır. Primordialler arası bölgenin (IPR) bu dağılımı, gelişmekte olan primordium ile merkezi bölge arasında yüksek GA sinyalleme aktivitesinin kademeli olarak oluşmasından kaynaklanırken, aynı zamanda primordiumdaki GA sinyalleme aktivitesi de azalmaktadır (Şekil 4c, d).
GID1b ve GID1c reseptörlerinin dağılımı (yukarıya bakınız), GA reseptörlerinin farklı ekspresyonlarının SAM'deki GA sinyal aktivitesi örüntüsünü şekillendirmeye yardımcı olduğunu göstermektedir. GA'nın farklı birikiminin rol oynayıp oynamadığını merak ettik. Bu olasılığı araştırmak için nlsGPS1 GA FRET sensörünü21 kullandık. 100 dakika boyunca 10 μM GA4+7 ile muamele edilen nlsGPS1'in SAM'inde artmış aktivasyon frekansı tespit edildi (Ek Şekil 9a–e), bu da nlsGPS1'in köklerde olduğu gibi SAM'deki GA konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt verdiğini göstermektedir21. nlsGPS1 aktivasyon frekansının mekansal dağılımı, SAM'in dış katmanlarında nispeten düşük GA seviyeleri ortaya koydu, ancak bunların SAM'in merkezinde ve sınırlarında yükseldiğini gösterdi (Şekil 4e ve Ek Şekil 9a,c). Bu, GA'nın SAM'de qmRGA ile ortaya çıkarılana benzer bir mekansal desenle dağıldığını göstermektedir. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, SAM'i floresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) veya negatif kontrol olarak tek başına Fl ile de tedavi ettik. Fl sinyali, daha düşük bir yoğunlukta da olsa, merkezi bölge ve primordium dahil olmak üzere SAM'in her yerine dağılmıştı (Şekil 4j ve Ek Şekil 10d). Buna karşılık, üç GA-Fl'nin tamamı, özellikle primordium sınırları içinde ve IPR'nin geri kalanında değişen derecelerde birikmiş ve GA7-Fl, IPR'deki en büyük alanda birikmiştir (Şekil 4k ve Ek Şekil 10a,b). Floresan yoğunluğunun kantifikasyonu, IPR/IPR olmayan yoğunluk oranının GA-Fl ile tedavi edilen SAM'de Fl ile tedavi edilen SAM'e kıyasla daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 4l ve Ek Şekil 10c). Bu sonuçlar bir araya geldiğinde, GA'nın organ sınırına en yakın bulunan IPR hücrelerinde daha yüksek konsantrasyonlarda bulunduğunu göstermektedir. Bu, SAM GA sinyal aktivitesi örüntüsünün hem GA reseptörlerinin farklı ekspresyonundan hem de organ sınırlarına yakın IPR hücrelerinde GA'nın farklı birikiminden kaynaklandığını göstermektedir. Dolayısıyla, analizimiz beklenmedik bir GA sinyalleme örüntüsü ortaya koymuştur; SAM'in merkezinde ve ilkel bölgesinde daha düşük aktivite, periferik bölgedeki IPR'de ise daha yüksek aktivite bulunmaktadır.
SAM'deki farklı GA sinyal aktivitesinin rolünü anlamak için, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS'nin gerçek zamanlı zaman atlamalı görüntülemesini kullanarak GA sinyal aktivitesi, hücre genişlemesi ve hücre bölünmesi arasındaki ilişkiyi analiz ettik. GA'nın büyüme düzenlemesindeki rolü göz önüne alındığında, hücre genişleme parametreleriyle pozitif bir korelasyon bekleniyordu. Bu nedenle, öncelikle GA sinyal aktivitesi haritalarını, hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarıyla (belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için hücre genişlemesinin gücünü temsil eden bir gösterge olarak) ve hücre genişlemesinin yönlülüğünü ölçen büyüme anizotropisi haritalarıyla (burada da belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için kullanılmıştır; Şekil 5a,b, Yöntemler ve Ek Yöntemler'e bakınız) karşılaştırdık. SAM hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarımız, sınırda minimum büyüme hızları ve gelişmekte olan çiçeklerde maksimum büyüme hızları ile önceki gözlemlerle38,39 tutarlıdır (Şekil 5a). Temel bileşen analizi (PCA), GA sinyalleme aktivitesinin hücre yüzeyi büyüme yoğunluğuyla negatif korelasyon gösterdiğini gösterdi (Şekil 5c). Ayrıca, GA sinyalleme girdisi ve büyüme yoğunluğu dahil olmak üzere ana varyasyon eksenlerinin, yüksek CLV3 ekspresyonu tarafından belirlenen yöne dik olduğunu gösterdik ve bu da kalan analizlerde hücrelerin SAM merkezinden dışlandığını doğruladı. Spearman korelasyon analizi PCA sonuçlarını doğruladı (Şekil 5d), IPR'deki daha yüksek GA sinyallerinin daha yüksek hücre genişlemesine yol açmadığını gösterdi. Bununla birlikte, korelasyon analizi GA sinyalleme aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasında hafif bir pozitif korelasyon olduğunu ortaya koydu (Şekil 5c, d), bu da IPR'deki daha yüksek GA sinyallemesinin hücre büyümesinin yönünü ve muhtemelen hücre bölünme düzleminin konumunu etkilediğini düşündürmektedir.
a, b Yedi bağımsız bitki üzerinde ortalaması alınan SAM'deki ortalama yüzey büyümesi (a) ve büyüme anizotropisinin (b) ısı haritaları (sırasıyla hücre genişlemesinin gücü ve yönü için vekil olarak kullanılmıştır). c PCA analizi şu değişkenleri içermektedir: GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu, yüzey büyüme anizotropisi ve CLV3 ekspresyonu. PCA bileşeni 1, yüzey büyüme yoğunluğu ile temel olarak negatif korelasyonlu ve GA sinyali ile pozitif korelasyonluydu. PCA bileşeni 2, yüzey büyüme anizotropisi ile temel olarak pozitif korelasyonlu ve CLV3 ekspresyonu ile negatif korelasyonluydu. Yüzdeler, her bir bileşen tarafından açıklanan varyasyonu temsil eder. d CZ hariç doku ölçeğinde GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu ve yüzey büyüme anizotropisi arasındaki Spearman korelasyon analizi. Sağdaki sayı, iki değişken arasındaki Spearman rho değeridir. Yıldız işaretleri, korelasyon/negatif korelasyonun oldukça anlamlı olduğu durumları göstermektedir. e Konfokal mikroskopi ile Col-0 SAM L1 hücrelerinin 3B görselleştirilmesi. 10. saatte SAM'de (ancak ilkel dokuda değil) oluşan yeni hücre duvarları, açı değerlerine göre renklendirilmiştir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilmiştir. Ekteki grafik, 0. saatteki ilgili 3B görüntüyü göstermektedir. Deney, benzer sonuçlar elde edilerek iki kez tekrarlanmıştır. f Kutu grafikleri, IPR ve IPR olmayan Col-0 SAM'deki hücre bölünme oranlarını göstermektedir (n = 10 bağımsız bitki). Ortadaki çizgi medyanı, kutu sınırları ise 25. ve 75. persentilleri göstermektedir. Bıyıklar, R yazılımı ile belirlenen minimum ve maksimum değerleri göstermektedir. P değerleri, Welch'in iki kuyruklu t-testi ile elde edilmiştir. g, h Şematik diyagram (g) yeni hücre duvarının (macenta) SAM'ın merkezinden (beyaz noktalı çizgi) radyal yöne göre açısının nasıl ölçüleceğini (sadece dar açı değerleri, yani 0–90° dikkate alınır) ve (h) meristem içindeki çevresel/yanal ve radyal yönleri göstermektedir. i Sırasıyla SAM (koyu mavi), IPR (orta mavi) ve IPR olmayan (açık mavi) hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edildi. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. j Sırasıyla P3 (açık yeşil), P4 (orta yeşil) ve P5 (koyu yeşil) etrafındaki IPR hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edildi. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı.
Bu nedenle, daha sonra deney sırasında yeni oluşan hücre duvarlarını belirleyerek GA sinyallemesi ile hücre bölünme aktivitesi arasındaki ilişkiyi araştırdık (Şekil 5e). Bu yaklaşım, hücre bölünme sıklığını ve yönünü ölçmemizi sağladı. Şaşırtıcı bir şekilde, IPR ve SAM'ın geri kalanındaki (IPR olmayan, Şekil 5f) hücre bölünme sıklığının benzer olduğunu bulduk; bu da IPR ve IPR olmayan hücreler arasındaki GA sinyallemesi farklılıklarının hücre bölünmesini önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir. Bu ve GA sinyallemesi ile büyüme anizotropisi arasındaki pozitif korelasyon, bizi GA sinyallemesi aktivitesinin hücre bölünme düzleminin yönelimini etkileyip etkilemediğini düşünmeye yöneltti. Yeni hücre duvarının yönelimini, meristem merkezini ve yeni hücre duvarının merkezini birleştiren radyal eksene göre dar açı olarak ölçtük (Şekil 5e-i) ve hücrelerin radyal eksene göre 90°'ye yakın açılarda bölünmeye yönelik açık bir eğilim gözlemledik, en yüksek frekanslar 70–80° (%23,28) ve 80–90° (%22,62) açılarda gözlendi (Şekil 5e,i), bu da çevresel/enine yöndeki hücre bölünmelerine karşılık geliyor (Şekil 5h). GA sinyallemesinin bu hücre bölünme davranışına katkısını incelemek için, IPR ve IPR olmayan hücre bölünme parametrelerini ayrı ayrı analiz ettik (Şekil 5i). IPR hücrelerindeki bölünme açısı dağılımının, IPR olmayan hücrelerdeki veya tüm SAM'deki hücrelerdeki dağılımdan farklı olduğunu, IPR hücrelerinin daha yüksek oranda yanal/dairesel hücre bölünmesi, yani 70–80° ve 80–90° (sırasıyla %33,86 ve %30,71, karşılık gelen oranlar) sergilediğini gözlemledik (Şekil 5i). Bu nedenle, gözlemlerimiz yüksek GA sinyallemesi ile çevresel yöne yakın bir hücre bölünme düzlemi yönelimi arasında, GA sinyalleme aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasındaki korelasyona benzer bir ilişki ortaya koydu (Şekil 5c, d). Bu ilişkinin mekansal korunumunu daha da belirlemek için, en yüksek GA sinyalleme aktivitesinin P4'ten başlayarak bu bölgede tespit edilmesi nedeniyle, P3'ten başlayarak primordiyumu çevreleyen IPR hücrelerinde bölünme düzlemi yönelimini ölçtük (Şekil 4). P3 ve P4 çevresindeki IPR'nin bölünme açıları istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermezken, P4 çevresindeki IPR'de yanal hücre bölünmelerinin sıklığında artış gözlendi (Şekil 5j). Ancak, P5 çevresindeki IPR hücrelerinde, hücre bölünme düzleminin yönelimindeki fark istatistiksel olarak anlamlı hale geldi ve enine hücre bölünmelerinin sıklığında keskin bir artış görüldü (Şekil 5j). Bu sonuçlar bir araya geldiğinde, GA sinyallemesinin SAM'deki hücre bölünmelerinin yönelimini kontrol edebileceğini düşündürmektedir; bu da yüksek GA sinyallemesinin IPR'de hücre bölünmelerinin yanal yönelimini tetikleyebileceği yönündeki önceki raporlarla40,41 tutarlıdır.
IPR'deki hücrelerin primordialara değil, internodlara dahil olacağı öngörülmektedir2,42,43. IPR'deki hücre bölünmelerinin enine yönelimi, internodlarda epidermal hücrelerin paralel uzunlamasına sıralarının tipik bir şekilde düzenlenmesiyle sonuçlanabilir. Yukarıda açıklanan gözlemlerimiz, GA sinyallemesinin hücre bölünmesinin yönünü düzenleyerek bu süreçte rol oynadığını göstermektedir.
Birkaç DELLA geninin fonksiyon kaybı, yapısal bir GA tepkisine yol açar ve bu hipotezi test etmek için della mutantları kullanılabilir44. İlk olarak, SAM'deki beş DELLA geninin ifade modellerini analiz ettik. GUS hattının45 transkripsiyonel füzyonu, GAI, RGA, RGL1 ve RGL2'nin (çok daha az ölçüde) SAM'de ifade edildiğini ortaya koydu (Ek Şekil 11a–d). İn situ hibridizasyon, GAI mRNA'sının özellikle ilkel bitkilerde ve gelişmekte olan çiçeklerde biriktiğini daha da gösterdi (Ek Şekil 11e). RGL1 ve RGL3 mRNA, SAM kanopisi boyunca ve daha yaşlı çiçeklerde tespit edilirken, RGL2 mRNA sınır bölgesinde daha boldu (Ek Şekil 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM'in konfokal görüntülemesi, in situ hibridizasyonla gözlemlenen ifadeyi doğruladı ve RGL3 proteininin SAM'in merkezi kısmında biriktiğini gösterdi (Ek Şekil 11i). pRGA::GFP-RGA hattını kullanarak, RGA proteininin SAM'de biriktiğini, ancak bolluğunun P4 sınırından itibaren azaldığını da bulduk (Ek Şekil 11j). Özellikle, RGL3 ve RGA'nın ifade kalıpları, qmRGA tarafından tespit edildiği gibi, IPR'de daha yüksek GA sinyal aktivitesiyle tutarlıdır (Şekil 4). Dahası, bu veriler tüm DELLA'ların SAM'de ifade edildiğini ve ifadelerinin toplu olarak tüm SAM'i kapsadığını göstermektedir.
Daha sonra hücre bölünme parametrelerini vahşi tip SAM'de (Ler, kontrol) ve gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beşli (global) mutantlarında analiz ettik (Şekil 6a, b). İlginç bir şekilde, della global mutant SAM'de hücre bölünme açısı frekanslarının dağılımında vahşi tipe kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir kayma gözlemledik (Şekil 6c). Della global mutantındaki bu değişiklik, 80–90° açılarının sıklığındaki artıştan (34,71% - %24,55) ve daha az ölçüde 70–80° açılarının sıklığındaki artıştan (23,78% - %20,18) kaynaklanıyordu, yani enine hücre bölünmelerine tekabül ediyordu (Şekil 6c). Enine olmayan bölünmelerin sıklığı (0–60°) de della global mutantında daha düşüktü (Şekil 6c). Della global mutantının SAM'ında enine hücre bölünmelerinin sıklığı önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6b). IPR'deki enine hücre bölünmelerinin sıklığı da della global mutantında vahşi tipe kıyasla daha yüksekti (Şekil 6d). IPR bölgesinin dışında, vahşi tip hücre bölünme açılarının daha düzgün bir dağılımına sahipken, della global mutantı IPR gibi teğetsel bölünmeleri tercih etmiştir (Şekil 6e). Ayrıca, GA'nın biriktiği GA-inaktif bir mutant arka planı olan ga2 oksidaz (ga2ox) beşli mutantlarının (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ve ga2ox6-2) SAM'ındaki hücre bölünmelerinin yönelimini de ölçtük. GA seviyelerindeki artışla uyumlu olarak, beşli ga2ox mutant çiçeklenmesinin SAM'ı Col-0'ınkinden daha büyüktü (Ek Şekil 12a, b) ve Col-0 ile karşılaştırıldığında, beşli ga2ox SAM hücre bölünme açılarının belirgin şekilde farklı bir dağılımını gösterdi; açı frekansı 50°'den 90°'ye çıktı, yani yine teğetsel bölünmeleri destekledi (Ek Şekil 12a–c). Bu nedenle, GA sinyallemesinin ve GA birikiminin yapısal aktivasyonunun IPR'de ve SAM'ın geri kalanında yanal hücre bölünmelerini indüklediğini gösteriyoruz.
a, b PI boyalı Ler (a) ve global della mutantı (b) SAM'in L1 tabakasının konfokal mikroskopi kullanılarak 3B görüntülenmesi. SAM'de (ancak primordiumda değil) 10 saatlik bir süre boyunca oluşan yeni hücre duvarları gösterilmiş ve açı değerlerine göre renklendirilmiştir. Ekteki resim 0. saatteki SAM'i göstermektedir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilmiştir. (b)'deki ok, global della mutantındaki hizalanmış hücre dosyalarına bir örnek göstermektedir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlanmıştır. ce Ler ve global della arasında tüm SAM'deki (d), IPR'deki (e) ve IPR olmayan (f) hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımlarının karşılaştırılması. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edilmiştir. f, g Col-0 (i) ve pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenik bitkilerinin PI boyalı SAM'inin konfokal görüntülerinin 3B görüntülenmesi. Paneller (a, b), SAM'de 10 saat içinde oluşan yeni hücre duvarlarını (ancak ilkel hücre duvarlarını değil) göstermektedir. Deney, benzer sonuçlar elde etmek için iki kez tekrarlanmıştır. h–j Col-0 ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkileri arasında tüm SAM'de (h), IPR'de (i) ve IPR olmayan (j) hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımlarının karşılaştırılması. P değerleri, iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edilmiştir.
Daha sonra, GA sinyallemesini özellikle IPR'de inhibe etmenin etkisini test ettik. Bu amaçla, VENUS ile kaynaşmış baskın bir negatif gai-1 proteininin ekspresyonunu (pCUC2::gai-1-VENUS hattında) yönlendirmek için kotiledon kap 2 (CUC2) promotörünü kullandık. Doğal tip SAM'de, CUC2 promotörü, sınır hücreleri de dahil olmak üzere SAM'deki çoğu IPR'nin ekspresyonunu P4'ten itibaren yönlendirir ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde de benzer spesifik ekspresyon gözlemlendi (aşağıya bakınız). pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinin SAM veya IPR'si boyunca hücre bölünme açılarının dağılımı, doğal tiptekinden önemli ölçüde farklı değildi; ancak beklenmedik bir şekilde, bu bitkilerde IPR'si olmayan hücrelerin 80-90° gibi daha yüksek bir frekansta bölündüğünü bulduk (Şekil 6f-j).
Hücre bölünme yönünün SAM'in geometrisine, özellikle de doku eğriliği tarafından oluşturulan çekme gerilimine bağlı olduğu öne sürülmüştür46. Bu nedenle, SAM'in şeklinin della global mutant ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde değişip değişmediğini sorduk. Daha önce bildirildiği gibi12, della global mutant SAM'in boyutu vahşi tipinkinden daha büyüktü (Ek Şekil 13a, b, d). CLV3 ve STM RNA'nın in situ hibridizasyonu, della mutantlarında meristem genişlemesini doğruladı ve ayrıca kök hücre nişinin yanal genişlemesini gösterdi (Ek Şekil 13e, f, h, i). Bununla birlikte, SAM eğriliği her iki genotipte de benzerdi (Ek Şekil 13k, m, n, p). Vahşi tiple karşılaştırıldığında eğrilikte bir değişiklik olmaksızın gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dörtlü mutantında benzer bir boyut artışı gözlemledik (Ek Şekil 13c, d, g, j, l, o, p). Della dörtlü mutantında hücre bölünme yöneliminin sıklığı da etkilendi, ancak della monolitik mutantındakinden daha az ölçüde (Ek Şekil 12d–f). Eğrilik üzerinde bir etkinin olmamasıyla birlikte bu dozaj etkisi, Della dörtlü mutantındaki artık RGL3 aktivitesinin, DELLA aktivitesinin kaybından kaynaklanan hücre bölünme yönelimindeki değişiklikleri sınırladığını ve yanal hücre bölünmelerindeki değişikliklerin SAM geometrisindeki değişikliklerden ziyade GA sinyalleme aktivitesindeki değişikliklere yanıt olarak meydana geldiğini düşündürmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, CUC2 promotörü, P4'ten başlayarak SAM'deki IPR ekspresyonunu yönlendirir (Ek Şekil 14a, b) ve buna karşılık, pCUC2::gai-1-VENUS SAM küçülmüş bir boyuta ancak daha yüksek bir eğriliğe sahipti (Ek Şekil 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki bu değişiklik, yüksek çevresel streslerin SAM merkezinden daha kısa bir mesafede başladığı doğal tipe kıyasla farklı bir mekanik stres dağılımına neden olabilir47. Alternatif olarak, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki değişiklikler, transgen ekspresyonu tarafından indüklenen bölgesel mekanik özelliklerdeki değişikliklerden kaynaklanıyor olabilir48. Her iki durumda da bu, hücrelerin çevresel/enine yönde bölünme olasılığını artırarak GA sinyallemesindeki değişikliklerin etkilerini kısmen dengeleyebilir ve gözlemlerimizi açıklayabilir.
Verilerimiz bir arada değerlendirildiğinde, yüksek GA sinyallemesinin IPR'deki hücre bölünme düzleminin yanal yöneliminde aktif bir rol oynadığını doğrulamaktadır. Ayrıca, meristem eğriliğinin de IPR'deki hücre bölünme düzleminin yönelimini etkilediğini göstermektedir.
Yüksek GA sinyalleme aktivitesi nedeniyle IPR'deki bölünme düzleminin enine yönelimi, GA'nın SAM içindeki epidermiste radyal bir hücre dosyasını önceden organize ederek daha sonra epidermal internodda bulunacak hücresel organizasyonu belirlediğini düşündürmektedir. Nitekim, bu tür hücre dosyaları, della global mutantlarının SAM görüntülerinde sıklıkla görülebilmektedir (Şekil 6b). Bu nedenle, SAM'deki GA sinyallemesinin uzamsal örüntüsünün gelişimsel işlevini daha ayrıntılı olarak incelemek için, vahşi tip (Ler ve Col-0), della global mutantları ve pCUC2::gai-1-VENUS transgenik bitkilerinde IPR'deki hücrelerin uzamsal organizasyonunu analiz etmek üzere zaman aralıklı görüntüleme kullandık.
qmRGA'nın IPR'deki GA sinyalleme aktivitesinin P1/P2'den arttığını ve P4'te zirveye ulaştığını ve bu modelin zaman içinde sabit kaldığını gösterdiğini bulduk (Şekil 4a–f ve Ek Şekil 8c–f, k). IPR'deki hücrelerin artan GA sinyaliyle mekansal organizasyonunu analiz etmek için, ilk gözlemden 34 saat sonra analiz edilen gelişimsel kaderlerine göre P4'ün üstünde ve yanlarında Ler IPR hücrelerini etiketledik, yani iki plastid zamanından daha uzun bir süre, bu bize IPR hücrelerini P1/P2'den P4'e kadar primordiyum gelişimi sırasında takip etme olanağı sağladı. Üç farklı renk kullandık: P4 yakınındaki primordiyuma entegre olan hücreler için sarı, IPR'de olanlar için yeşil ve her iki işleme de katılanlar için mor (Şekil 7a–c). t0'da (0 saat), P4'ün önünde 1–2 kat IPR hücresi görüldü (Şekil 7a). Beklendiği gibi, bu hücreler bölündüklerinde bunu çoğunlukla enine bölünme düzlemi üzerinden yaptılar (Şekil 7a–c). Col-0 SAM kullanılarak da benzer sonuçlar elde edildi (sınırları Ler'deki P4'e benzer şekilde katlanan P3'e odaklanıldı), ancak bu genotipte floral sınırda oluşan kat, IPR hücrelerini daha hızlı gizledi (Şekil 7g–i). Dolayısıyla, IPR hücrelerinin bölünme düzeni, hücreleri internodlardaki gibi radyal sıralar halinde önceden organize eder. Radyal sıraların organizasyonu ve IPR hücrelerinin ardışık organlar arasındaki yerleşimi, bu hücrelerin internodal progenitörler olduğunu düşündürmektedir.
Burada, birleşik GA ve GA reseptör konsantrasyonlarından kaynaklanan GA sinyal aktivitesinin kantitatif haritalanmasına olanak tanıyan ve endojen sinyal yollarıyla etkileşimi en aza indirerek hücresel düzeyde GA işlevi hakkında bilgi sağlayan oransal bir GA sinyal biyosensörü olan qmRGA'yı geliştirdik. Bu amaçla, DELLA etkileşim partnerlerine bağlanma yeteneğini kaybetmiş ancak GA kaynaklı proteolize duyarlı kalan modifiye edilmiş bir DELLA proteini olan mRGA'yı oluşturduk. qmRGA, GA seviyelerindeki hem ekzojen hem de endojen değişikliklere yanıt verir ve dinamik algılama özellikleri, gelişim sırasında GA sinyal aktivitesindeki zaman-mekansal değişikliklerin değerlendirilmesini sağlar. qmRGA ayrıca, ekspresyonu için kullanılan promotörü değiştirerek (gerekirse) farklı dokulara uyarlanabildiği için oldukça esnek bir araçtır ve GA sinyal yolunun ve anjiyospermler genelindeki PFYRE motifinin korunan yapısı göz önüne alındığında, diğer türlere de aktarılabilir olması muhtemeldir22. Bununla tutarlı olarak, pirinç SLR1 DELLA proteinindeki (HYY497AAA) eşdeğer bir mutasyonun, mRGA23'e benzer şekilde, SLR1'in büyüme baskılayıcı aktivitesini baskılarken, GA aracılı bozunmasını yalnızca biraz azalttığı da gösterilmiştir. Özellikle, Arabidopsis'teki son çalışmalar, PFYRE alanındaki (S474L) tek bir amino asit mutasyonunun, transkripsiyon faktörü ortaklarıyla etkileşime girme yeteneğini etkilemeden RGA'nın transkripsiyonel aktivitesini değiştirdiğini göstermiştir50. Bu mutasyon mRGA'da bulunan 3 amino asit değişimine çok yakın olmasına rağmen, çalışmalarımız bu iki mutasyonun DELLA'nın farklı özelliklerini değiştirdiğini göstermektedir. Çoğu transkripsiyon faktörü ortağı DELLA'nın LHR1 ve SAW alanlarına bağlansa da26,51, PFYRE alanındaki bazı korunmuş amino asitler bu etkileşimlerin stabilize edilmesine yardımcı olabilir.
Boğum arası gelişim, bitki mimarisinde ve verim artışında önemli bir özelliktir. qmRGA, IPR boğum arası progenitör hücrelerinde daha yüksek GA sinyal aktivitesi ortaya koydu. Kantitatif görüntüleme ve genetiği birleştirerek, GA sinyal örüntülerinin SAM epidermisinde dairesel/enine hücre bölünme düzlemlerini üst üste bindirdiğini ve boğum arası gelişim için gerekli hücre bölünme organizasyonunu şekillendirdiğini gösterdik. Gelişim sırasında hücre bölünme düzlemi yöneliminin çeşitli düzenleyicileri tanımlanmıştır52,53. Çalışmamız, GA sinyal aktivitesinin bu hücresel parametreyi nasıl düzenlediğine dair açık bir örnek sunmaktadır. DELLA, ön katlama protein kompleksleriyle etkileşime girebilir41, bu nedenle GA sinyallemesi, kortikal mikrotübül yönelimini doğrudan etkileyerek hücre bölünme düzlemi yönelimini düzenleyebilir40,41,54,55. Beklenmedik bir şekilde, SAM'de daha yüksek GA sinyal aktivitesinin korelasyonunun hücre uzaması veya bölünmesi değil, yalnızca büyüme anizotropisi olduğunu gösterdik; bu da GA'nın IPR'deki hücre bölünme yönü üzerindeki doğrudan etkisiyle tutarlıdır. Ancak, bu etkinin dolaylı da olabileceğini, örneğin GA ile indüklenen hücre duvarı yumuşaması tarafından aracılık edildiğini göz ardı edemeyiz56. Hücre duvarı özelliklerindeki değişiklikler mekanik strese neden olur57,58, bu da kortikal mikrotübüllerin yönelimini etkileyerek hücre bölünme düzleminin yönelimini etkileyebilir39,46,59. GA ile indüklenen mekanik stresin ve GA tarafından mikrotübül yöneliminin doğrudan düzenlenmesinin birleşik etkileri, internodları tanımlamak için IPR'de belirli bir hücre bölünme yönelimi modelinin oluşturulmasında rol oynayabilir ve bu fikri test etmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, önceki çalışmalar internod oluşumunun kontrolünde DELLA ile etkileşen TCP14 ve 15 proteinlerinin önemini vurgulamıştır60,61 ve bu faktörler GA'nın internod gelişimini düzenleyen ve GA sinyallemesini etkilediği gösterilen BREVIPEDICELLUS (BP) ve PENNYWISE (PNY) ile birlikte etkisini aracılık ediyor olabilir2,62. DELLA'ların brassinosteroid, etilen, jasmonik asit ve absisik asit (ABA) sinyal yollarıyla etkileşime girdiği63,64 ve bu hormonların mikrotübül yönelimini etkileyebildiği65 göz önüne alındığında, GA'nın hücre bölünme yönelimi üzerindeki etkileri diğer hormonlar tarafından da aracılık edilebilir.
Erken sitolojik çalışmalar, Arabidopsis SAM'ın hem iç hem de dış bölgelerinin internod gelişimi için gerekli olduğunu göstermiştir2,42. GA'nın iç dokularda hücre bölünmesini aktif olarak düzenlemesi12, GA'nın SAM'da meristem ve internod boyutunu düzenlemede ikili bir işlevi olduğunu desteklemektedir. Yönlendirilmiş hücre bölünme düzeni de iç SAM dokusunda sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu düzenleme gövde büyümesi için gereklidir52. GA'nın iç SAM organizasyonunda hücre bölünme düzleminin yönlendirilmesinde ve dolayısıyla SAM içindeki internodların belirlenmesi ve gelişiminin senkronize edilmesinde de bir rol oynayıp oynamadığını incelemek ilginç olacaktır.
Bitkiler, hipokotil ve kök büyüme deneyleri hariç, %1 sukroz ve %1 agar (Sigma) ile desteklenmiş toprakta veya 1x Murashige-Skoog (MS) besiyerinde (Duchefa) standart koşullar altında (16 saat ışık, 22 °C) in vitro olarak yetiştirildi; bu deneylerde fideler sabit ışık ve 22 °C'de dikey plakalarda yetiştirildi. Nitrat deneyleri için bitkiler, yeterli nitrat (0 veya 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-süksinat, %1 sukroz ve %1 A-agar (Sigma) ile desteklenmiş modifiye MS besiyerinde (bioWORLD bitki besiyeri) uzun gün koşulları altında yetiştirildi.
pDONR221'e eklenen GID1a cDNA'sı, pDONR P4-P1R-pUBQ10 ve pDONR P2R-P3-mCherry ile pB7m34GW'de rekombine edilerek pUBQ10::GID1a-mCherry oluşturuldu. pDONR221'e eklenen IDD2 DNA'sı, pB7RWG266'da rekombine edilerek p35S:IDD2-RFP oluşturuldu. pGID1b::2xmTQ2-GID1b'yi üretmek için, GID1b kodlama bölgesinin yukarısında 3,9 kb'lik bir parça ve GID1b cDNA'sını (1,3 kb) ve sonlandırıcıyı (3,4 kb) içeren 4,7 kb'lik bir parça ilk önce Ek Tablo 3'teki primerler kullanılarak çoğaltıldı ve ardından sırasıyla pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ve pDONR P2R-P3'e (Thermo Fisher Scientific) eklendi ve son olarak pDONR221 2xmTQ268 ile Gateway klonlama kullanılarak pGreen 012567 hedef vektörüne rekombinasyon uygulandı. pCUC2::LSSmOrange'ı üretmek için, CUC2 promotör dizisi (ATG'den 3229 bp yukarı akış), ardından N7 nükleer lokalizasyon sinyali ve NOS transkripsiyonel sonlandırıcı içeren büyük Stokes kaydırmalı mOrange (LSSmOrange)69'un kodlama dizisi, Gateway 3-fragman rekombinasyon sistemi (Invitrogen) kullanılarak pGreen kanamisin hedefleme vektörüne birleştirildi. Bitki ikili vektörü, Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101'e tanıtıldı ve sırasıyla Agrobacterium infiltrasyon yöntemi ile Nicotiana benthamiana yapraklarına ve çiçek daldırma yöntemi ile Arabidopsis thaliana Col-0'a tanıtıldı. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ve pCLV3::mCherry-NLS qmRGA, sırasıyla ilgili çaprazlamaların F3 ve F1 yavrularından izole edildi.
Yaklaşık 1 cm uzunluğundaki sürgün uçlarında RNA in situ hibridizasyonu gerçekleştirildi72. Bu uçlar toplanıp hemen 4 °C'ye önceden soğutulmuş FAA solüsyonunda (%3,7 formaldehit, %5 asetik asit, %50 etanol) fiksasyona tabi tutuldu. 2 x 15 dakikalık vakum uygulamalarından sonra fiksatif değiştirildi ve örnekler bir gece inkübe edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ve RGL3 cDNA'ları ve bunların 3'-UTR'lerine ait antisens probları, Rosier ve ark. tarafından açıklandığı gibi Ek Tablo 3'te gösterilen primerler kullanılarak sentezlendi73. Digoksigenin etiketli problar, digoksigenin antikorları (3000 kat seyreltme; Roche, katalog numarası: 11 093 274 910) kullanılarak immünolojik olarak tespit edildi ve kesitler 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, 250 kat seyreltme)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 kat seyreltme) solüsyonu ile boyandı.
Gönderi zamanı: 10 Şubat 2025