Sürgün ucu meristeminin (SAM) büyümesi, gövde yapısı için kritik öneme sahiptir. Bitki hormonlarıgibberellinler(GA'lar) bitki büyümesinin koordinasyonunda önemli roller oynar, ancak SAM'deki rolleri hala yeterince anlaşılmamıştır. Burada, GA transkripsiyonel yanıtındaki temel düzenleyici işlevini baskılamak ve GA tanınması üzerine bozunmasını korumak için DELLA proteinini tasarlayarak GA sinyallemesinin oran tabanlı bir biyosensörünü geliştirdik. Bu bozunmaya dayalı biyosensörün, gelişim sırasında GA seviyelerindeki ve hücresel algılamadaki değişiklikleri doğru bir şekilde kaydettiğini gösterdik. Bu biyosensörü SAM'deki GA sinyalleme aktivitesini haritalamak için kullandık. Yüksek GA sinyallerinin, internod hücrelerinin öncüleri olan organ primordiyaları arasında yer alan hücrelerde ağırlıklı olarak bulunduğunu gösterdik. Fonksiyon kazanımı ve kaybı yaklaşımlarını kullanarak, GA'nın hücre bölünme düzleminin yönünü düzenlediğini, internodların kanonik hücresel organizasyonunu oluşturduğunu ve böylece SAM'de internod spesifikasyonunu desteklediğini daha da gösterdik.
Sürgün ucunda bulunan sürgün apikal meristemi (SAM), bitkinin yaşamı boyunca modüler ve tekrarlayan bir şekilde yanal organlar ve gövde düğümleri oluşturan kök hücrelerden oluşan bir niş içerir. Bu tekrarlayan birimlerin veya bitki düğümlerinin her biri, düğümlerde internodlar ve yanal organlar ile yaprak koltuklarında aksiller meristemler içerir¹. Bitki düğümlerinin büyümesi ve organizasyonu gelişim sırasında değişir. Arabidopsis'te, vejetatif evrede internodal büyüme baskılanır ve aksiller meristemler rozet yapraklarının koltuklarında uykuda kalır. Çiçeklenme evresine geçiş sırasında, SAM, uzamış internodlar ve aksiller tomurcuklar, gövde yapraklarının koltuklarında dalcıklar ve daha sonra yapraksız çiçekler oluşturan çiçeklenme meristemi haline gelir². Yaprakların, çiçeklerin ve dalların oluşumunu kontrol eden mekanizmaları anlamada önemli ilerleme kaydetmiş olsak da, internodların nasıl oluştuğu hakkında nispeten az şey bilinmektedir.
GA'ların uzamsal ve zamansal dağılımını anlamak, bu hormonların farklı dokulardaki ve farklı gelişim aşamalarındaki işlevlerini daha iyi anlamaya yardımcı olacaktır. Kendi promotörünün etkisi altında ifade edilen RGA-GFP füzyonunun bozunmasının görselleştirilmesi, köklerdeki toplam GA seviyelerinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlar15,16. Bununla birlikte, RGA ifadesi dokular arasında değişir17 ve GA18 tarafından düzenlenir. Bu nedenle, RGA promotörünün farklı ifadesi, RGA-GFP ile gözlemlenen floresan desenine neden olabilir ve bu nedenle bu yöntem nicel değildir. Daha yakın zamanlarda, biyolojik olarak aktif floresan (Fl) etiketli GA19,20, kök endokorteksinde GA birikimini ve hücresel seviyelerinin GA taşınmasıyla düzenlenmesini ortaya koymuştur. Son zamanlarda, GA FRET sensörü nlsGPS1, GA seviyelerinin köklerde, filamentlerde ve karanlıkta yetiştirilen hipokotillerde hücre uzamasıyla ilişkili olduğunu göstermiştir21. Ancak, gördüğümüz gibi, GA konsantrasyonu, GA sinyal aktivitesini kontrol eden tek parametre değildir, çünkü karmaşık algılama süreçlerine bağlıdır. Burada, DELLA ve GA sinyal yolları hakkındaki anlayışımıza dayanarak, GA sinyallemesi için bozunmaya dayalı oranometrik bir biyosensörün geliştirilmesini ve karakterizasyonunu rapor ediyoruz. Bu kantitatif biyosensörü geliştirmek için, floresan bir proteine kaynaştırılmış ve dokularda yaygın olarak ifade edilen mutant GA'ya duyarlı bir RGA'nın yanı sıra GA'ya duyarsız bir floresan protein kullandık. Mutant RGA protein füzyonlarının yaygın olarak ifade edildiğinde endojen GA sinyallemesine müdahale etmediğini ve bu biyosensörün hem GA girdisinden hem de algılama cihazı tarafından GA sinyal işlenmesinden kaynaklanan sinyal aktivitesini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle ölçebildiğini gösteriyoruz. Bu biyosensörü, GA sinyal aktivitesinin uzamsal ve zamansal dağılımını haritalamak ve GA'nın SAM epidermisinde hücresel davranışı nasıl düzenlediğini ölçmek için kullandık. GA'nın, organ primordiyaları arasında yer alan SAM hücrelerinin bölünme düzleminin yönelimini düzenlediğini ve böylece internodun kanonik hücresel organizasyonunu tanımladığını gösteriyoruz.
Son olarak, qmRGA'nın büyüyen hipokotiller kullanılarak endojen GA seviyelerindeki değişiklikleri rapor edip edemeyeceğini sorduk. Daha önce nitratın GA sentezini ve dolayısıyla DELLA34 bozunmasını artırarak büyümeyi uyardığını göstermiştik. Buna göre, bol miktarda nitrat (10 mM NO3−) altında yetiştirilen pUBQ10::qmRGA fidelerinin hipokotil uzunluğunun, nitrat eksikliği koşullarında yetiştirilen fidelerden önemli ölçüde daha uzun olduğunu gözlemledik (Ek Şekil 6a). Büyüme tepkisiyle tutarlı olarak, 10 mM NO3− koşullarında yetiştirilen fidelerin hipokotillerindeki GA sinyalleri, nitrat yokluğunda yetiştirilen fidelerden daha yüksekti (Ek Şekil 6b, c). Bu nedenle, qmRGA ayrıca endojen GA konsantrasyonundaki değişikliklerin neden olduğu GA sinyallemesindeki değişikliklerin izlenmesini de mümkün kılar.
qmRGA tarafından algılanan GA sinyal aktivitesinin, sensör tasarımına dayanarak beklendiği gibi, GA konsantrasyonuna ve GA algısına bağlı olup olmadığını anlamak için, üç GID1 reseptörünün vejetatif ve üreme dokularındaki ekspresyonunu analiz ettik. Fidelerde, GID1-GUS raporlayıcı hattı, GID1a ve c'nin kotiledonlarda yüksek oranda eksprese edildiğini gösterdi (Şekil 3a–c). Ek olarak, üç reseptörün tamamı yapraklarda, yan kök primordiyalarında, kök uçlarında (GID1b'nin kök kapağı hariç) ve vasküler sistemde eksprese edildi (Şekil 3a–c). Çiçeklenme SAM'ında, GUS sinyallerini yalnızca GID1b ve 1c için tespit ettik (Ek Şekil 7a–c). İn situ hibridizasyon bu ekspresyon modellerini doğruladı ve ayrıca GID1c'nin SAM'da düşük seviyelerde homojen olarak eksprese edildiğini, GID1b'nin ise SAM'ın çevresinde daha yüksek ekspresyon gösterdiğini ortaya koydu (Ek Şekil 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasyonel füzyonu ayrıca, SAM'ın merkezinde düşük veya hiç ekspresyon olmamasından organ sınırlarında yüksek ekspresyona kadar kademeli bir GID1b ekspresyon aralığı ortaya koymuştur (Ek Şekil 7m). Bu nedenle, GID1 reseptörleri dokular arasında ve dokular içinde homojen olarak dağılmamıştır. Sonraki deneylerde, GID1'in aşırı ekspresyonunun (pUBQ10::GID1a-mCherry), hipokotillerdeki qmRGA'nın dış GA uygulamasına duyarlılığını artırdığını da gözlemledik (Şekil 3d, e). Buna karşılık, hipokotilde qd17mRGA tarafından ölçülen floresans, GA3 tedavisine duyarsızdı (Şekil 3f, g). Her iki deney için de, sensörün hızlı davranışını değerlendirmek amacıyla fideler yüksek konsantrasyonlarda GA (100 μM GA3) ile muamele edildi; burada GID1 reseptörüne bağlanma yeteneği artırıldı veya kaybedildi. Bu sonuçlar, qmRGA biyosensörünün hem GA hem de GA sensörü olarak birleşik bir işlev gördüğünü doğrulamakta ve GID1 reseptörünün farklı ifadesinin sensörün emisyonunu önemli ölçüde değiştirebileceğini düşündürmektedir.
Bugüne kadar, SAM'deki GA sinyallerinin dağılımı belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, SAM büyümesinin kontrolünde önemli bir rol oynadığı için L1 katmanına (epidermis; Şekil 4a, b, bkz. Yöntemler ve Ek Yöntemler) odaklanarak, GA sinyal aktivitesinin yüksek çözünürlüklü kantitatif haritalarını hesaplamak için qmRGA eksprese eden bitkileri ve pCLV3::mCherry-NLS kök hücre muhabirini35 kullandık. Burada, pCLV3::mCherry-NLS ekspresyonu, GA sinyal aktivitesinin uzamsal ve zamansal dağılımını analiz etmek için sabit bir geometrik referans noktası sağladı37. GA'nın yanal organ gelişimi için gerekli olduğu düşünülse de4, P3 aşamasından itibaren çiçek primordiyumunda (P) GA sinyallerinin düşük olduğunu (Şekil 4a, b), genç P1 ve P2 primordiyumlarının ise merkezi bölgedekine benzer orta düzeyde aktiviteye sahip olduğunu gözlemledik (Şekil 4a, b). Daha yüksek GA sinyal aktivitesi, P1/P2'den (sınırın kenarlarında) başlayarak P4'te zirveye ulaşan organ primordiyum sınırlarında ve primordiyumlar arasında yer alan çevresel bölgenin tüm hücrelerinde tespit edildi (Şekil 4a, b ve Ek Şekil 8a, b). Bu daha yüksek GA sinyal aktivitesi sadece epidermiste değil, aynı zamanda L2 ve üst L3 katmanlarında da gözlemlendi (Ek Şekil 8b). qmRGA kullanılarak SAM'da tespit edilen GA sinyallerinin deseni de zaman içinde değişmeden kaldı (Ek Şekil 8c–f, k). Ayrıntılı olarak karakterize ettiğimiz beş bağımsız hattan T3 bitkilerinin SAM'ında qd17mRGA yapısı sistematik olarak aşağı regüle edilmiş olsa da, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP yapısı ile elde edilen floresans desenlerini analiz edebildik (Ek Şekil 8g–j, l). Bu kontrol hattında, SAM'de floresans oranında yalnızca küçük değişiklikler tespit edildi, ancak SAM merkezinde TagBFP ile ilişkili VENUS'ta açık ve beklenmedik bir azalma gözlemledik. Bu, qmRGA tarafından gözlemlenen sinyal modelinin mRGA-VENUS'un GA'ya bağlı bozunmasını yansıttığını doğrulamakla kalmaz, aynı zamanda qmRGA'nın meristem merkezindeki GA sinyal aktivitesini abartabileceğini de gösterir. Özetle, sonuçlarımız öncelikle primordiyumların dağılımını yansıtan bir GA sinyal modelini ortaya koymaktadır. Primordiyumlar arası bölgenin (IPR) bu dağılımı, gelişmekte olan primordiyum ile merkezi bölge arasında yüksek GA sinyal aktivitesinin kademeli olarak oluşmasından kaynaklanırken, aynı zamanda primordiyumdaki GA sinyal aktivitesi azalmaktadır (Şekil 4c, d).
GID1b ve GID1c reseptörlerinin dağılımı (yukarıya bakınız), GA reseptörlerinin farklı ekspresyonunun SAM'deki GA sinyal aktivitesinin şeklini belirlemeye yardımcı olduğunu düşündürmektedir. GA'nın farklı birikiminin de rol oynayıp oynamadığını merak ettik. Bu olasılığı araştırmak için nlsGPS1 GA FRET sensörünü kullandık21. 10 μM GA4+7 ile 100 dakika süreyle işlem görmüş nlsGPS1'in SAM'inde artan aktivasyon frekansı tespit edildi (Ek Şekil 9a–e), bu da nlsGPS1'in köklerde olduğu gibi SAM'deki GA konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt verdiğini göstermektedir21. nlsGPS1 aktivasyon frekansının uzamsal dağılımı, SAM'in dış katmanlarında nispeten düşük GA seviyeleri gösterirken, merkezde ve SAM'in sınırlarında yükseldiğini ortaya koydu (Şekil 4e ve Ek Şekil 9a,c). Bu, GA'nın da qmRGA tarafından ortaya çıkarılanla karşılaştırılabilir bir uzamsal örüntüyle SAM'da dağıldığını göstermektedir. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, SAM'ı floresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) veya negatif kontrol olarak sadece Fl ile de işleme tabi tuttuk. Fl sinyali, merkezi bölge ve primordiyum da dahil olmak üzere SAM boyunca dağılmıştı, ancak daha düşük bir yoğunlukta (Şekil 4j ve Ek Şekil 10d). Buna karşılık, üç GA-Fl'nin tamamı özellikle primordiyum sınırları içinde ve IPR'nin geri kalanında değişen derecelerde birikti; GA7-Fl ise IPR'deki en büyük alanda birikti (Şekil 4k ve Ek Şekil 10a,b). Floresans yoğunluğunun nicel analizi, GA-Fl ile tedavi edilen SAM'da IPR/IPR olmayan yoğunluk oranının Fl ile tedavi edilen SAM'a kıyasla daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4l ve Ek Şekil 10c). Bu sonuçlar, GA'nın organ sınırına en yakın konumda bulunan IPR hücrelerinde daha yüksek konsantrasyonlarda bulunduğunu göstermektedir. Bu, SAM GA sinyal aktivitesinin modelinin hem GA reseptörlerinin farklı ekspresyonundan hem de organ sınırlarına yakın IPR hücrelerinde GA'nın farklı birikiminden kaynaklandığını düşündürmektedir. Dolayısıyla, analizimiz, SAM'ın merkezinde ve primordiyumunda daha düşük aktivite ve çevresel bölgedeki IPR'de daha yüksek aktivite ile beklenmedik bir uzamsal-zamansal GA sinyal modeli ortaya koymuştur.
SAM'deki farklı GA sinyal aktivitesinin rolünü anlamak için, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS'nin gerçek zamanlı zaman atlamalı görüntülemesini kullanarak GA sinyal aktivitesi, hücre genişlemesi ve hücre bölünmesi arasındaki korelasyonu analiz ettik. GA'nın büyüme düzenlemesindeki rolü göz önüne alındığında, hücre genişleme parametreleriyle pozitif bir korelasyon bekleniyordu. Bu nedenle, öncelikle GA sinyal aktivitesi haritalarını, hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarıyla (belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için hücre genişlemesinin gücünün bir göstergesi olarak) ve hücre genişlemesinin yönünü ölçen büyüme anizotropisi haritalarıyla (burada da belirli bir hücre ve bölünmedeki yavru hücreler için kullanılmıştır; Şekil 5a,b, bkz. Yöntemler ve Ek Yöntemler) karşılaştırdık. SAM hücre yüzeyi büyüme hızı haritalarımız, sınırda minimum büyüme hızları ve gelişmekte olan çiçeklerde maksimum büyüme hızları ile önceki gözlemlerle tutarlıdır38,39 (Şekil 5a). Ana bileşen analizi (PCA), GA sinyal aktivitesinin hücre yüzeyi büyüme yoğunluğu ile negatif korelasyon gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 5c). Ayrıca, GA sinyal girdisi ve büyüme yoğunluğu da dahil olmak üzere ana varyasyon eksenlerinin, yüksek CLV3 ekspresyonu tarafından belirlenen yöne dik olduğunu gösterdik ve bu da kalan analizlerde SAM merkezinden hücrelerin dışlanmasını doğruladı. Spearman korelasyon analizi, PCA sonuçlarını doğruladı (Şekil 5d), IPR'deki daha yüksek GA sinyallerinin daha yüksek hücre genişlemesine yol açmadığını gösterdi. Bununla birlikte, korelasyon analizi, GA sinyal aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasında hafif bir pozitif korelasyon ortaya koydu (Şekil 5c, d), bu da IPR'deki daha yüksek GA sinyalinin hücre büyümesinin yönünü ve muhtemelen hücre bölünme düzleminin konumunu etkilediğini düşündürmektedir.
a, b Yedi bağımsız bitki üzerinde ortalama alınan SAM'deki ortalama yüzey büyümesinin (a) ve büyüme anizotropisinin (b) ısı haritaları (sırasıyla hücre genişlemesinin gücü ve yönü için vekil olarak kullanılmıştır). c PCA analizine şu değişkenler dahil edilmiştir: GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu, yüzey büyüme anizotropisi ve CLV3 ifadesi. PCA bileşeni 1, esas olarak yüzey büyüme yoğunluğu ile negatif, GA sinyali ile pozitif korelasyon göstermiştir. PCA bileşeni 2, esas olarak yüzey büyüme anizotropisi ile pozitif, CLV3 ifadesi ile negatif korelasyon göstermiştir. Yüzdeler, her bileşen tarafından açıklanan varyasyonu temsil eder. d CZ hariç doku ölçeğinde GA sinyali, yüzey büyüme yoğunluğu ve yüzey büyüme anizotropisi arasındaki Spearman korelasyon analizi. Sağdaki sayı, iki değişken arasındaki Spearman rho değeridir. Yıldız işaretleri, korelasyonun/negatif korelasyonun oldukça anlamlı olduğu durumları gösterir. e Konfokal mikroskopi ile Col-0 SAM L1 hücrelerinin 3 boyutlu görselleştirilmesi. 10 saatte SAM'da (ancak primordiyumda değil) oluşan yeni hücre duvarları, açı değerlerine göre renklendirilmiştir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilmiştir. Ek kısım, 0 saatteki karşılık gelen 3 boyutlu görüntüyü göstermektedir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. f Kutu grafikleri, IPR ve IPR olmayan Col-0 SAM'daki hücre bölünme oranlarını göstermektedir (n = 10 bağımsız bitki). Orta çizgi medyanı, kutu sınırları ise 25. ve 75. yüzdelikleri göstermektedir. Bıyıklar, R yazılımı ile belirlenen minimum ve maksimum değerleri göstermektedir. P değerleri, Welch'in iki kuyruklu t-testi ile elde edilmiştir. g, h Şematik diyagram, (g) yeni hücre duvarının (macenta) SAM merkezinden (beyaz noktalı çizgi) radyal yöne göre açısının nasıl ölçüleceğini (sadece dar açı değerleri, yani 0–90°, dikkate alınmıştır) ve (h) meristem içindeki çevresel/yanal ve radyal yönleri göstermektedir. i Sırasıyla SAM (koyu mavi), IPR (orta mavi) ve IPR olmayan (açık mavi) boyunca hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edilmiştir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. j Sırasıyla P3 (açık yeşil), P4 (orta yeşil) ve P5 (koyu yeşil) çevresindeki IPR'nin hücre bölünme düzlemi yöneliminin frekans histogramları. P değerleri iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi ile elde edilmiştir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı.
Bu nedenle, daha sonra deney sırasında yeni oluşan hücre duvarlarını belirleyerek GA sinyallemesi ile hücre bölünme aktivitesi arasındaki korelasyonu araştırdık (Şekil 5e). Bu yaklaşım, hücre bölünmesinin sıklığını ve yönünü ölçmemizi sağladı. Şaşırtıcı bir şekilde, IPR'deki ve SAM'ın geri kalanındaki (IPR olmayan, Şekil 5f) hücre bölünme sıklığının benzer olduğunu bulduk; bu da IPR ve IPR olmayan hücreler arasındaki GA sinyallemesindeki farklılıkların hücre bölünmesini önemli ölçüde etkilemediğini gösteriyor. Bu ve GA sinyallemesi ile büyüme anizotropisi arasındaki pozitif korelasyon, GA sinyalleme aktivitesinin hücre bölünme düzleminin yönünü etkileyip etkilemediğini düşünmemize yol açtı. Yeni hücre duvarının yönelimini, meristem merkezi ile yeni hücre duvarının merkezini birleştiren radyal eksene göre dar bir açı olarak ölçtük (Şekil 5e-i) ve hücrelerin radyal eksene göre 90°'ye yakın açılarda bölünme eğilimini açıkça gözlemledik; en yüksek frekanslar 70-80° (%23,28) ve 80-90° (%22,62)'de gözlemlendi (Şekil 5e,i), bu da çevresel/enine yöndeki hücre bölünmelerine karşılık gelmektedir (Şekil 5h). GA sinyalinin bu hücre bölünme davranışına katkısını incelemek için, IPR ve IPR olmayan bölgelerdeki hücre bölünme parametrelerini ayrı ayrı analiz ettik (Şekil 5i). IPR hücrelerindeki bölünme açısı dağılımının, IPR olmayan hücrelerden veya tüm SAM'deki hücrelerden farklı olduğunu gözlemledik; IPR hücreleri, daha yüksek oranda yanal/dairesel hücre bölünmesi sergiliyordu, yani 70–80° ve 80–90° (sırasıyla %33,86 ve %30,71) (Şekil 5i). Bu nedenle, gözlemlerimiz, yüksek GA sinyallemesi ile hücre bölünme düzleminin çevresel yöne yakın bir yönelimi arasında, GA sinyalleme aktivitesi ile büyüme anizotropisi arasındaki korelasyona benzer bir ilişki ortaya koydu (Şekil 5c, d). Bu ilişkinin mekansal korunmasını daha da doğrulamak için, en yüksek GA sinyalleme aktivitesinin P4'ten itibaren bu bölgede tespit edilmesi nedeniyle, P3'ten itibaren primordiyumu çevreleyen IPR hücrelerindeki bölünme düzlemi yönelimini ölçtük (Şekil 4). P3 ve P4 çevresindeki IPR'nin bölünme açılarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi, ancak P4 çevresindeki IPR'de yanal hücre bölünmelerinin sıklığında bir artış gözlemlendi (Şekil 5j). Bununla birlikte, P5 çevresindeki IPR hücrelerinde, hücre bölünme düzleminin yönelimindeki fark istatistiksel olarak anlamlı hale geldi ve enine hücre bölünmelerinin sıklığında keskin bir artış görüldü (Şekil 5j). Bu sonuçlar, GA sinyallemesinin SAM'deki hücre bölünmelerinin yönelimini kontrol edebileceğini göstermektedir; bu da yüksek GA sinyallemesinin IPR'de hücre bölünmelerinin yanal yönelimini indükleyebileceğine dair önceki raporlarla40,41 tutarlıdır.
IPR'deki hücrelerin primordiyalara değil, internodlara dahil edileceği tahmin edilmektedir2,42,43. IPR'deki hücre bölünmelerinin enine yönelimi, internodlarda epidermal hücrelerin tipik paralel uzunlamasına sıralarının organizasyonuna yol açabilir. Yukarıda açıklanan gözlemlerimiz, GA sinyallemesinin hücre bölünmesinin yönünü düzenleyerek bu süreçte rol oynadığını düşündürmektedir.
Birkaç DELLA geninin işlev kaybı, konstitütif bir GA yanıtına neden olur ve della mutantları bu hipotezi test etmek için kullanılabilir44. İlk olarak, SAM'deki beş DELLA geninin ekspresyon kalıplarını analiz ettik. GUS hattının transkripsiyonel füzyonu45, GAI, RGA, RGL1 ve RGL2'nin (çok daha az oranda) SAM'de eksprese edildiğini ortaya koydu (Ek Şekil 11a–d). İn situ hibridizasyon ayrıca GAI mRNA'sının özellikle primordiyalarda ve gelişmekte olan çiçeklerde biriktiğini gösterdi (Ek Şekil 11e). RGL1 ve RGL3 mRNA'sı SAM örtüsü boyunca ve daha yaşlı çiçeklerde tespit edilirken, RGL2 mRNA'sı sınır bölgesinde daha bol miktarda bulundu (Ek Şekil 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM'ın konfokal görüntülemesi, in situ hibridizasyon ile gözlemlenen ifadeyi doğruladı ve RGL3 proteininin SAM'ın merkezi kısmında biriktiğini gösterdi (Ek Şekil 11i). pRGA::GFP-RGA hattını kullanarak, RGA proteininin de SAM'da biriktiğini, ancak P4'ten başlayarak sınırda bolluğunun azaldığını bulduk (Ek Şekil 11j). Özellikle, RGL3 ve RGA'nın ifade kalıpları, qmRGA ile tespit edildiği gibi, IPR'deki daha yüksek GA sinyal aktivitesiyle tutarlıdır (Şekil 4). Dahası, bu veriler tüm DELLA'ların SAM'da ifade edildiğini ve ifadelerinin topluca tüm SAM'ı kapsadığını göstermektedir.
Daha sonra, yabani tip SAM'da (Ler, kontrol) ve gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beşli (küresel) mutantlarında hücre bölünme parametrelerini analiz ettik (Şekil 6a, b). İlginç bir şekilde, della küresel mutant SAM'da hücre bölünme açısı frekanslarının dağılımında yabani tipe kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir kayma gözlemledik (Şekil 6c). Della küresel mutantındaki bu değişiklik, 80-90° açılarının (34.71% vs. 24.55%) ve daha az oranda 70-80° açılarının (23.78% vs. 20.18%), yani enine hücre bölünmelerine karşılık gelen açıların frekansındaki artıştan kaynaklanıyordu (Şekil 6c). Enine olmayan bölünmelerin (0-60°) frekansı da della küresel mutantında daha düşüktü (Şekil 6c). Della global mutantının SAM bölgesinde enine hücre bölünmelerinin sıklığı önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6b). IPR bölgesindeki enine hücre bölünmelerinin sıklığı da, yabani tipe kıyasla della global mutantında daha yüksektir (Şekil 6d). IPR bölgesinin dışında, yabani tipte hücre bölünme açılarının daha homojen bir dağılımı varken, della global mutantı IPR gibi teğetsel bölünmeleri tercih etmiştir (Şekil 6e). Ayrıca, GA'nın biriktiği GA-inaktif bir mutant arka planı olan ga2 oksidaz (ga2ox) beşli mutantlarının (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ve ga2ox6-2) SAM bölgesindeki hücre bölünmelerinin yönelimini de ölçtük. GA seviyelerindeki artışla tutarlı olarak, beşli ga2ox mutantının çiçek salkımının SAM'ı Col-0'unkinden daha büyüktü (Ek Şekil 12a, b) ve Col-0 ile karşılaştırıldığında, beşli ga2ox SAM'ı, hücre bölünme açılarının belirgin şekilde farklı bir dağılımını gösterdi; açı frekansı 50°'den 90°'ye yükseldi, yani yine teğetsel bölünmeleri destekledi (Ek Şekil 12a-c). Böylece, GA sinyallemesinin konstitütif aktivasyonunun ve GA birikiminin IPR'de ve SAM'ın geri kalanında yanal hücre bölünmelerini tetiklediğini gösteriyoruz.
a, b PI ile boyanmış Ler (a) ve global della mutantının (b) SAM'ının L1 katmanının konfokal mikroskopi kullanılarak 3 boyutlu görselleştirilmesi. 10 saatlik bir süre boyunca SAM'da (ancak primordiyumda değil) oluşan yeni hücre duvarları, açı değerlerine göre renklendirilmiş olarak gösterilmiştir. Ek resim, 0 saatteki SAM'ı göstermektedir. Renk çubuğu sağ alt köşede gösterilmiştir. (b)'deki ok, global della mutantındaki hizalanmış hücre dizilerinin bir örneğini göstermektedir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. c Ler ve global della arasında tüm SAM'da (d), IPR'de (e) ve IPR olmayan (f) hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımının karşılaştırılması. P değerleri, iki kuyruklu Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edildi. f, g Col-0 (i) ve pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenik bitkilerinin PI ile boyanmış SAM'ının konfokal görüntülerinin 3 boyutlu görselleştirilmesi. Paneller (a, b), 10 saat içinde SAM'da oluşan yeni hücre duvarlarını (ancak primordiyaları değil) göstermektedir. Deney benzer sonuçlarla iki kez tekrarlandı. h–j Col-0 ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkileri arasında tüm SAM'da (h), IPR'de (i) ve IPR olmayan bölgede (j) bulunan hücre bölünme düzlemi yönelimlerinin frekans dağılımının karşılaştırılması. P değerleri iki yönlü Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak elde edildi.
Daha sonra, GA sinyallemesinin özellikle IPR'de inhibe edilmesinin etkisini test ettik. Bu amaçla, VENUS'a kaynaştırılmış dominant negatif gai-1 proteininin ekspresyonunu yönlendirmek için kotiledon kupa 2 (CUC2) promotörünü kullandık (pCUC2::gai-1-VENUS hattında). Vahşi tip SAM'da, CUC2 promotörü, P4'ten itibaren sınır hücreleri de dahil olmak üzere SAM'daki çoğu IPR'nin ekspresyonunu yönlendirir ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde de benzer spesifik ekspresyon gözlemlendi (aşağıya bakınız). pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinin SAM veya IPR'si boyunca hücre bölünme açılarının dağılımı, vahşi tipinkinden önemli ölçüde farklı değildi, ancak beklenmedik bir şekilde bu bitkilerde IPR'si olmayan hücrelerin 80-90°'lik daha yüksek bir sıklıkta bölündüğünü bulduk (Şekil 6f-j).
Hücre bölünmesinin yönünün, özellikle doku eğriliğinin oluşturduğu gerilme stresi olmak üzere, SAM'ın geometrisine bağlı olduğu öne sürülmüştür46. Bu nedenle, della global mutant ve pCUC2::gai-1-VENUS bitkilerinde SAM'ın şeklinin değişip değişmediğini araştırdık. Daha önce bildirildiği gibi12, della global mutant SAM'ın boyutu yabani tipinkinden daha büyüktü (Ek Şekil 13a, b, d). CLV3 ve STM RNA'nın in situ hibridizasyonu, della mutantlarında meristem genişlemesini doğruladı ve ayrıca kök hücre nişinin yanal genişlemesini gösterdi (Ek Şekil 13e, f, h, i). Bununla birlikte, SAM eğriliği her iki genotipte de benzerdi (Ek Şekil 13k, m, n, p). Vahşi tipe kıyasla eğrilikte bir değişiklik olmaksızın gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dörtlü mutantında da benzer bir boyut artışı gözlemledik (Ek Şekil 13c, d, g, j, l, o, p). Hücre bölünme yöneliminin sıklığı da della dörtlü mutantında etkilendi, ancak della monolitik mutantına göre daha az ölçüde (Ek Şekil 12d–f). Bu dozaj etkisi, eğrilik üzerindeki etki eksikliğiyle birlikte, Della dörtlü mutantındaki kalıntı RGL3 aktivitesinin, DELLA aktivitesinin kaybından kaynaklanan hücre bölünme yönelimindeki değişiklikleri sınırladığını ve yanal hücre bölünmelerindeki değişikliklerin SAM geometrisindeki değişikliklerden ziyade GA sinyal aktivitesindeki değişikliklere yanıt olarak meydana geldiğini düşündürmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, CUC2 promotörü P4'ten itibaren SAM'da IPR ekspresyonunu yönlendirir (Ek Şekil 14a, b) ve buna karşılık, pCUC2::gai-1-VENUS SAM'ın boyutu küçülmüş ancak eğriliği daha yüksekti (Ek Şekil 14c-h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki bu değişiklik, yüksek çevresel gerilimlerin SAM merkezinden daha kısa bir mesafede başladığı vahşi tipe kıyasla farklı bir mekanik gerilim dağılımına neden olabilir47. Alternatif olarak, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfolojisindeki değişiklikler, transgen ekspresyonu tarafından indüklenen bölgesel mekanik özelliklerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir48. Her iki durumda da, bu, hücrelerin çevresel/enine yönde bölünme olasılığını artırarak GA sinyallemesindeki değişikliklerin etkilerini kısmen dengeleyebilir ve gözlemlerimizi açıklayabilir.
Verilerimiz bir araya getirildiğinde, daha yüksek GA sinyallemesinin IPR'deki hücre bölünme düzleminin yanal yöneliminde aktif bir rol oynadığını doğrulamaktadır. Ayrıca, meristem eğriliğinin de IPR'deki hücre bölünme düzleminin yönelimini etkilediğini göstermektedir.
Yüksek GA sinyal aktivitesi nedeniyle IPR'deki bölünme düzleminin enine yönelimi, GA'nın epidermis içinde SAM'da radyal bir hücre dizisi önceden düzenleyerek daha sonra epidermal internodda bulunacak hücresel organizasyonu tanımladığını düşündürmektedir. Gerçekten de, bu tür hücre dizileri della global mutantlarının SAM görüntülerinde sıklıkla görülebiliyordu (Şekil 6b). Bu nedenle, SAM'daki GA sinyalinin uzamsal deseninin gelişimsel işlevini daha ayrıntılı olarak incelemek için, yabani tip (Ler ve Col-0), della global mutantları ve pCUC2::gai-1-VENUS transgenik bitkilerinde IPR'deki hücrelerin uzamsal organizasyonunu analiz etmek için zaman atlamalı görüntüleme kullandık.
qmRGA'nın, IPR'deki GA sinyal aktivitesinin P1/P2'den itibaren arttığını ve P4'te zirveye ulaştığını ve bu modelin zaman içinde sabit kaldığını gösterdiğini bulduk (Şekil 4a–f ve Ek Şekil 8c–f, k). Artan GA sinyali ile IPR'deki hücrelerin uzamsal organizasyonunu analiz etmek için, ilk gözlemden 34 saat sonra, yani iki plastid zamanından fazla bir süre sonra analiz edilen gelişimsel kaderlerine göre P4'ün üstündeki ve yanlarındaki Ler IPR hücrelerini etiketledik; bu da IPR hücrelerini P1/P2'den P4'e kadar primordiyum gelişimi sırasında takip etmemizi sağladı. Üç farklı renk kullandık: P4'e yakın primordiyuma entegre olan hücreler için sarı, IPR'de bulunanlar için yeşil ve her iki süreçte de yer alanlar için mor (Şekil 7a–c). t0'da (0 saat), P4'ün önünde 1-2 katman IPR hücresi görülebiliyordu (Şekil 7a). Beklendiği gibi, bu hücreler bölündüğünde, bunu esas olarak enine bölünme düzlemi yoluyla yaptılar (Şekil 7a–c). Col-0 SAM kullanılarak da benzer sonuçlar elde edildi (sınırı Ler'deki P4'e benzer şekilde kıvrılan P3'e odaklanarak), ancak bu genotipte çiçek sınırında oluşan kıvrım IPR hücrelerini daha hızlı gizledi (Şekil 7g–i). Bu nedenle, IPR hücrelerinin bölünme modeli, hücreleri internodlarda olduğu gibi radyal sıralar halinde önceden düzenler. Radyal sıraların organizasyonu ve IPR hücrelerinin ardışık organlar arasında lokalizasyonu, bu hücrelerin internodal progenitörler olduğunu düşündürmektedir.
Burada, endojen sinyal yollarına müdahaleyi en aza indirirken, birleşik GA ve GA reseptör konsantrasyonlarından kaynaklanan GA sinyal aktivitesinin kantitatif haritasını çıkarmaya olanak tanıyan, böylece hücresel düzeyde GA fonksiyonu hakkında bilgi sağlayan, oran tabanlı bir GA sinyal biyosensörü olan qmRGA'yı geliştirdik. Bu amaçla, DELLA etkileşim ortaklarına bağlanma yeteneğini kaybetmiş ancak GA kaynaklı proteolize duyarlı kalmış modifiye bir DELLA proteini olan mRGA'yı oluşturduk. qmRGA, hem eksojen hem de endojen GA seviyelerindeki değişikliklere yanıt verir ve dinamik algılama özellikleri, gelişim sırasında GA sinyal aktivitesindeki uzamsal ve zamansal değişikliklerin değerlendirilmesini sağlar. qmRGA ayrıca, ekspresyonu için kullanılan promotörü değiştirerek (gerekirse) farklı dokulara uyarlanabildiği için çok esnek bir araçtır ve GA sinyal yolunun ve PFYRE motifinin anjiyospermler genelinde korunmuş doğası göz önüne alındığında, diğer türlere de aktarılabilir olması muhtemeldir22. Buna paralel olarak, pirinç SLR1 DELLA proteininde (HYY497AAA) eşdeğer bir mutasyonun, SLR1'in büyüme baskılayıcı aktivitesini bastırdığı, ancak GA aracılı bozunmasını mRGA23'e benzer şekilde yalnızca hafifçe azalttığı gösterilmiştir. Özellikle, Arabidopsis'te yapılan son çalışmalar, PFYRE alanındaki tek bir amino asit mutasyonunun (S474L), transkripsiyon faktörü ortaklarıyla etkileşim yeteneğini etkilemeden RGA'nın transkripsiyonel aktivitesini değiştirdiğini göstermiştir50. Bu mutasyon, mRGA'da bulunan 3 amino asit ikamesine çok yakın olmasına rağmen, çalışmalarımız bu iki mutasyonun DELLA'nın farklı özelliklerini değiştirdiğini göstermektedir. Çoğu transkripsiyon faktörü ortağı DELLA'nın LHR1 ve SAW alanlarına bağlanırken26,51, PFYRE alanındaki bazı korunmuş amino asitler bu etkileşimleri stabilize etmeye yardımcı olabilir.
Düğüm arası gelişimi, bitki mimarisi ve verim artışında önemli bir özelliktir. qmRGA, IPR düğüm arası öncü hücrelerinde daha yüksek GA sinyal aktivitesini ortaya koymuştur. Kantitatif görüntüleme ve genetiği birleştirerek, GA sinyal kalıplarının SAM epidermisinde dairesel/enine hücre bölünme düzlemlerini üst üste bindirdiğini ve düğüm arası gelişimi için gerekli hücre bölünme organizasyonunu şekillendirdiğini gösterdik. Gelişim sırasında hücre bölünme düzlemi yöneliminin çeşitli düzenleyicileri tanımlanmıştır52,53. Çalışmamız, GA sinyal aktivitesinin bu hücresel parametreyi nasıl düzenlediğine dair net bir örnek sunmaktadır. DELLA, ön katlanma protein kompleksleriyle etkileşime girebilir41, bu nedenle GA sinyallemesi, kortikal mikrotübül yönelimini doğrudan etkileyerek hücre bölünme düzlemi yönelimini düzenleyebilir40,41,54,55. Beklenmedik bir şekilde, SAM'da daha yüksek GA sinyal aktivitesinin korelasyonunun hücre uzaması veya bölünmesi değil, yalnızca büyüme anizotropisi olduğunu gösterdik; bu da GA'nın IPR'deki hücre bölünme yönü üzerindeki doğrudan etkisiyle tutarlıdır. Ancak, bu etkinin dolaylı da olabileceğini, örneğin GA kaynaklı hücre duvarı yumuşaması56 aracılığıyla gerçekleşebileceğini göz ardı edemeyiz. Hücre duvarı özelliklerindeki değişiklikler mekanik strese neden olur57,58 ve bu da kortikal mikrotübüllerin yönelimini etkileyerek hücre bölünme düzleminin yönelimini etkileyebilir39,46,59. GA kaynaklı mekanik stresin ve GA tarafından mikrotübül yöneliminin doğrudan düzenlenmesinin birleşik etkileri, internodları tanımlamak için IPR'de belirli bir hücre bölünme yönelimi modeli oluşturmada rol oynayabilir ve bu fikri test etmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, önceki çalışmalar, internod oluşumunun kontrolünde DELLA ile etkileşen proteinler TCP14 ve 15'in önemini vurgulamıştır60,61 ve bu faktörler, internod gelişimini düzenleyen ve GA sinyallemesini etkilediği gösterilen BREVIPEDICELLUS (BP) ve PENNYWISE (PNY) ile birlikte GA'nın etkisine aracılık edebilir2,62. DELLA'ların brassinosteroid, etilen, jasmonik asit ve absisik asit (ABA) sinyal yollarıyla etkileşime girdiği63,64 ve bu hormonların mikrotübül yönelimini etkileyebildiği65 göz önüne alındığında, GA'nın hücre bölünmesi yönelimi üzerindeki etkileri diğer hormonlar aracılığıyla da gerçekleşebilir.
Erken dönem sitolojik çalışmalar, Arabidopsis SAM'ın hem iç hem de dış bölgelerinin internod gelişimi için gerekli olduğunu göstermiştir2,42. GA'nın iç dokularda hücre bölünmesini aktif olarak düzenlemesi12, GA'nın SAM'da meristem ve internod boyutunu düzenlemede ikili bir işlevi olduğunu desteklemektedir. Yönlü hücre bölünmesi modeli de iç SAM dokusunda sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu düzenleme gövde büyümesi için gereklidir52. GA'nın iç SAM organizasyonunda hücre bölünme düzlemini yönlendirmede de rol oynayıp oynamadığını, böylece SAM içindeki internodların belirlenmesini ve gelişimini senkronize edip etmediğini incelemek ilginç olacaktır.
Bitkiler, hipokotil ve kök büyüme deneyleri hariç, standart koşullar altında (16 saat ışık, 22 °C) toprakta veya %1 sukroz ve %1 agar (Sigma) ile desteklenmiş 1x Murashige-Skoog (MS) ortamında (Duchefa) in vitro olarak yetiştirildi. Hipokotil ve kök büyüme deneylerinde ise fideler, sabit ışık ve 22 °C altında dikey plakalarda yetiştirildi. Nitrat deneyleri için bitkiler, uzun gün koşulları altında yeterli miktarda nitrat (0 veya 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-süksinat, %1 sukroz ve %1 A-agar (Sigma) ile desteklenmiş modifiye MS ortamında (bioWORLD bitki ortamı) yetiştirildi.
pDONR221'e yerleştirilen GID1a cDNA'sı, pDONR P4-P1R-pUBQ10 ve pDONR P2R-P3-mCherry ile rekombine edilerek pB7m34GW'ye dönüştürüldü ve böylece pUBQ10::GID1a-mCherry oluşturuldu. pDONR221'e yerleştirilen IDD2 DNA'sı ise pB7RWG266'ya rekombine edilerek p35S:IDD2-RFP oluşturuldu. pGID1b::2xmTQ2-GID1b'yi oluşturmak için, GID1b kodlama bölgesinin yukarısında yer alan 3,9 kb'lık bir fragman ve GID1b cDNA'sını (1,3 kb) ve sonlandırıcıyı (3,4 kb) içeren 4,7 kb'lık bir fragman, önce Ek Tablo 3'teki primerler kullanılarak çoğaltıldı ve daha sonra sırasıyla pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ve pDONR P2R-P3'e (Thermo Fisher Scientific) eklendi ve son olarak Gateway klonlama yöntemi kullanılarak pDONR221 2xmTQ268 ile pGreen 012567 hedef vektörüne rekombine edildi. pCUC2::LSSmOrange'ı oluşturmak için, CUC2 promotör dizisi (ATG'nin 3229 bp yukarısında), N7 nükleer lokalizasyon sinyali ve NOS transkripsiyon sonlandırıcısı ile birlikte büyük Stokes kaydırmalı mOrange (LSSmOrange)69'un kodlama dizisi, Gateway 3-fragment rekombinasyon sistemi (Invitrogen) kullanılarak pGreen kanamisin hedefleme vektörüne monte edildi. Bitki ikili vektörü, Agrobacterium tumefaciens GV3101 suşuna ve Nicotiana benthamiana yapraklarına Agrobacterium infiltrasyon yöntemiyle ve Arabidopsis thaliana Col-0'a çiçek daldırma yöntemiyle sırasıyla aktarıldı. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry ve pCLV3::mCherry-NLS qmRGA, ilgili çaprazlamaların F3 ve F1 yavrularından sırasıyla izole edildi.
RNA in situ hibridizasyonu, yaklaşık 1 cm uzunluğundaki sürgün uçlarında gerçekleştirildi72; bu uçlar toplandıktan hemen sonra 4 °C'ye önceden soğutulmuş FAA çözeltisinde (%3,7 formaldehit, %5 asetik asit, %50 etanol) sabitlendi. 2 × 15 dakikalık vakum işleminden sonra, sabitleyici değiştirildi ve örnekler bir gece boyunca inkübe edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ve RGL3 cDNA'ları ve bunların 3'-UTR'lerine yönelik antisens probları, Rosier ve ark.73 tarafından açıklandığı gibi Ek Tablo 3'te gösterilen primerler kullanılarak sentezlendi. Digoksigenin etiketli problar, digoksigenin antikorları (3000 kat seyreltme; Roche, katalog numarası: 11 093 274 910) kullanılarak immünolojik olarak tespit edildi ve kesitler 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, 250 kat seyreltme)/nitroblue tetrazolyum (NBT, 200 kat seyreltme) çözeltisi ile boyandı.
Yayın tarihi: 10 Şubat 2025