Bu çalışmada, kombine tedavinin uyarıcı etkileri incelenmiştir.bitki büyüme düzenleyicileri*Hypericum perforatum* L. bitkisinde in vitro morfojenez ve ikincil metabolit üretimi üzerindeki 2,4-D ve kinetin ile demir oksit nanopartiküllerinin (Fe₃O₄-NPs) etkileri araştırıldı. Optimize edilmiş tedavi [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)], bitki büyüme parametrelerini önemli ölçüde iyileştirdi: kontrol grubuna kıyasla bitki boyu %59,6, kök uzunluğu %114,0, tomurcuk sayısı %180,0 ve kallus taze ağırlığı %198,3 arttı. Bu kombine tedavi ayrıca rejenerasyon verimliliğini (%50,85) artırdı ve hiperisin içeriğini %66,6 oranında yükseltti. GC-MS analizi, toplam pik alanının %93,36'sını oluşturan yüksek miktarda hiperosid, β-patolen ve setil alkol içerdiğini, toplam fenolik ve flavonoid içeriğinin ise %80,1 oranında arttığını ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, bitki büyüme düzenleyicilerinin (PGR'ler) ve Fe₃O₄ nanopartiküllerinin (Fe₃O₄-NP'ler) organogenezi ve biyoaktif bileşiklerin birikimini uyararak sinerjik bir etki gösterdiğini ve tıbbi bitkilerin biyoteknolojik olarak iyileştirilmesi için umut vadeden bir strateji oluşturduğunu göstermektedir.
Sarı kantaron (Hypericum perforatum L.), diğer adıyla sarı kantaron, ekonomik değeri olan Hypericaceae familyasına ait çok yıllık otsu bir bitkidir.[1] Potansiyel biyoaktif bileşenleri arasında doğal tanenler, ksantonlar, floroglukinol, naftalendiantron (hiperin ve psödo hiperin), flavonoidler, fenolik asitler ve uçucu yağlar bulunur.[2,3,4] Sarı kantaron geleneksel yöntemlerle çoğaltılabilir; ancak geleneksel yöntemlerin mevsimselliği, düşük tohum çimlenmesi ve hastalıklara karşı duyarlılığı, büyük ölçekli yetiştirilmesi ve ikincil metabolitlerin sürekli oluşumu potansiyelini sınırlamaktadır.[1,5,6]
Bu nedenle, in vitro doku kültürü, hızlı bitki çoğaltımı, genetik kaynakların korunması ve tıbbi bileşiklerin veriminin artırılması için etkili bir yöntem olarak kabul edilmektedir [7, 8]. Bitki büyüme düzenleyicileri (PGR'ler), morfojenezin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve kallus ve tüm organizmaların in vitro kültivasyonu için gereklidir. Konsantrasyonlarının ve kombinasyonlarının optimizasyonu, bu gelişimsel süreçlerin başarılı bir şekilde tamamlanması için çok önemlidir [9]. Bu nedenle, düzenleyicilerin uygun bileşimini ve konsantrasyonunu anlamak, St. John's wort'un (H. perforatum) büyüme ve rejeneratif kapasitesini iyileştirmek için önemlidir [10].
Demir oksit nanopartikülleri (Fe₃O₄), doku kültürü için geliştirilmiş veya geliştirilmekte olan bir nanopartikül sınıfıdır. Fe₃O₄, önemli manyetik özelliklere, iyi biyo-uyumluluğa ve bitki büyümesini teşvik etme ve çevresel stresi azaltma yeteneğine sahip olduğundan, doku kültürü tasarımlarında önemli bir ilgi çekmiştir. Bu nanopartiküllerin potansiyel uygulamaları arasında hücre bölünmesini teşvik etmek, besin alımını iyileştirmek ve antioksidan enzimleri aktive etmek için in vitro kültürü optimize etmek yer alabilir [11].
Nanopartiküllerin bitki büyümesi üzerinde iyi bir teşvik edici etkiye sahip olduğu gösterilmiş olsa da, *H. perforatum* bitkisinde Fe₃O₄ nanopartikülleri ve optimize edilmiş bitki büyüme düzenleyicilerinin birlikte uygulanmasına ilişkin çalışmalar azdır. Bu bilgi boşluğunu doldurmak için, bu çalışma, tıbbi bitkilerin özelliklerini iyileştirmek için yeni bilgiler sağlamak amacıyla, bunların birleşik etkilerinin in vitro morfojenez ve ikincil metabolit üretimi üzerindeki etkilerini değerlendirmiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın iki amacı vardır: (1) kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu ve köklenmeyi in vitro olarak etkili bir şekilde teşvik etmek için bitki büyüme düzenleyicilerinin konsantrasyonunu optimize etmek; ve (2) Fe₃O₄ nanopartiküllerinin in vitro büyüme parametreleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek. Gelecek planları arasında, rejenerasyon sırasında (in vitro) rejenerasyon bitkilerinin hayatta kalma oranının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu çalışmanın sonuçlarının, *H. perforatum* bitkisinin mikro çoğaltma verimliliğini önemli ölçüde artırarak, bu önemli tıbbi bitkinin sürdürülebilir kullanımına ve biyoteknolojik uygulamalarına katkıda bulunması beklenmektedir.
Bu çalışmada, tarlada yetiştirilen yıllık St. John's wort bitkilerinden (ana bitkiler) yaprak eksplantları elde ettik. Bu eksplantlar, in vitro kültür koşullarını optimize etmek için kullanıldı. Kültürlemeden önce, yapraklar birkaç dakika boyunca akan damıtılmış su altında iyice durulandı. Daha sonra eksplant yüzeyleri, 30 saniye boyunca %70 etanolde, ardından birkaç damla Tween 20 içeren %1,5 sodyum hipoklorit (NaOCl) çözeltisinde 10 dakika süreyle bekletilerek dezenfekte edildi. Son olarak, eksplantlar bir sonraki kültür ortamına aktarılmadan önce steril damıtılmış su ile üç kez durulandı.
Sonraki dört hafta boyunca, yenilenme oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu dahil olmak üzere sürgün yenilenme parametreleri ölçüldü. Yenilenen sürgünler en az 2 cm uzunluğa ulaştığında, yarı güçlü MS ortamı, 0,5 mg/L indolbütirik asit (IBA) ve %0,3 guar zamkından oluşan bir köklendirme ortamına aktarıldı. Köklendirme kültürü üç hafta boyunca devam etti ve bu süre zarfında köklenme oranı, kök sayısı ve kök uzunluğu ölçüldü. Her uygulama üç kez tekrarlandı ve her tekrarda 10 eksplant kültüre alındı, bu da uygulama başına yaklaşık 30 eksplant elde edilmesini sağladı.
Bitki yüksekliği, bitkinin tabanından en uzun yaprağın ucuna kadar bir cetvel kullanılarak santimetre (cm) cinsinden ölçüldü. Kök uzunluğu, fideler dikkatlice çıkarıldıktan ve yetiştirme ortamı uzaklaştırıldıktan hemen sonra milimetre (mm) cinsinden ölçüldü. Her bitkideki tomurcuk sayısı doğrudan sayıldı. Yapraklardaki nodül olarak bilinen siyah noktaların sayısı görsel olarak ölçüldü. Bu siyah nodüllerin hiperisin içeren bezler veya oksidatif noktalar olduğuna inanılmaktadır ve bitkinin tedaviye verdiği tepkinin fizyolojik bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. Tüm yetiştirme ortamı uzaklaştırıldıktan sonra, fidelerin taze ağırlığı miligram (mg) hassasiyetinde elektronik bir terazi kullanılarak ölçüldü.
Kallus oluşum hızını hesaplama yöntemi şu şekildedir: Eksplantlar dört hafta boyunca çeşitli büyüme düzenleyicileri (kinazlar, 2,4-D ve Fe3O4) içeren bir ortamda kültüre edildikten sonra, kallus oluşturabilen eksplant sayısı sayılır. Kallus oluşum hızını hesaplama formülü ise şöyledir:
Her tedavi üç kez tekrarlandı ve her tekrarda en az 10 doku örneği incelendi.
Yenilenme oranı, kallus oluşum aşamasından sonra tomurcuk farklılaşma sürecini başarıyla tamamlayan kallus dokusunun oranını yansıtır. Bu gösterge, kallus dokusunun farklılaşmış dokuya dönüşme ve yeni bitki organlarına doğru büyüme yeteneğini ortaya koymaktadır.
Köklenme katsayısı, köklenebilen dal sayısının toplam dal sayısına oranıdır. Bu gösterge, mikro çoğaltma ve bitki çoğaltmada çok önemli olan köklenme aşamasının başarısını yansıtır; çünkü iyi bir köklenme, fidelerin büyüme koşullarında daha iyi hayatta kalmasına yardımcı olur.
Hiperisin bileşikleri %90 metanol ile ekstrakte edildi. 50 mg kurutulmuş bitki materyali 1 ml metanole eklendi ve oda sıcaklığında karanlıkta bir ultrasonik temizleyicide (model A5120-3YJ) 30 kHz'de 20 dakika boyunca sonikasyon uygulandı. Sonikasyondan sonra numune 15 dakika boyunca 6000 rpm'de santrifüjlendi. Süpernatant toplandı ve hiperisinin absorbansı, Conceiçao ve ark. [14] tarafından açıklanan yönteme göre Plus-3000 S spektrofotometre kullanılarak 592 nm'de ölçüldü.
Bitki büyüme düzenleyicileri (PGR'ler) ve demir oksit nanopartikülleri (Fe₃O₄-NP'ler) ile yapılan çoğu tedavi, yenilenmiş sürgün yapraklarında siyah nodül oluşumuna neden olmadı. 0,5 veya 1 mg/L 2,4-D, 0,5 veya 1 mg/L kinetin veya 1, 2 veya 4 mg/L demir oksit nanopartikülleri ile yapılan hiçbir tedavide nodül gözlenmedi. Birkaç kombinasyon, kinetin ve/veya demir oksit nanopartiküllerinin daha yüksek konsantrasyonlarında (istatistiksel olarak anlamlı olmasa da) nodül gelişiminde hafif bir artış gösterdi; örneğin 2,4-D (0,5–2 mg/L) ile kinetin (1–1,5 mg/L) ve demir oksit nanopartiküllerinin (2–4 mg/L) kombinasyonu. Bu sonuçlar Şekil 2'de gösterilmiştir. Siyah nodüller, hem doğal olarak oluşan hem de faydalı olan hiperisin açısından zengin bezleri temsil eder. Bu çalışmada, siyah nodüller esas olarak dokuların kahverengileşmesiyle ilişkilendirildi ve hiperisin birikimi için elverişli bir ortam olduğunu gösterdi. 2,4-D, kinetin ve Fe₃O₄ nanopartikülleri ile yapılan tedavi, kallus büyümesini teşvik etti, kahverengileşmeyi azalttı ve klorofil içeriğini artırdı; bu da metabolik fonksiyonun iyileştiğini ve oksidatif hasarın potansiyel olarak azaldığını düşündürmektedir [37]. Bu çalışma, kinetinin 2,4-D ve Fe₃O₄ nanopartikülleri ile kombinasyonunun St. John's wort kallusunun büyüme ve gelişmesi üzerindeki etkilerini değerlendirdi (Şekil 3a–g). Önceki çalışmalar, Fe₃O₄ nanopartiküllerinin antifungal ve antimikrobiyal aktivitelere sahip olduğunu [38, 39] ve bitki büyüme düzenleyicileriyle birlikte kullanıldığında bitki savunma mekanizmalarını uyarabileceğini ve hücresel stres indekslerini azaltabileceğini göstermiştir [18]. İkincil metabolitlerin biyosentezi genetik olarak düzenlenmiş olsa da, gerçek verimleri çevresel koşullara büyük ölçüde bağlıdır. Metabolik ve morfolojik değişiklikler, belirli bitki genlerinin ekspresyonunu düzenleyerek ve çevresel faktörlere yanıt vererek ikincil metabolit seviyelerini etkileyebilir. Ayrıca, indükleyiciler yeni genlerin aktivasyonunu tetikleyebilir, bu da enzimatik aktiviteyi uyararak nihayetinde birden fazla biyosentetik yolu aktive eder ve ikincil metabolitlerin oluşumuna yol açar. Dahası, başka bir çalışma, gölgelemenin azaltılmasının güneş ışığına maruz kalmayı artırdığını ve böylece *Hypericum perforatum*'un doğal yaşam alanında gündüz sıcaklıklarını yükselttiğini ve bunun da hiperisin veriminin artmasına katkıda bulunduğunu göstermiştir. Bu verilere dayanarak, bu çalışma, demir nanopartiküllerinin doku kültüründe potansiyel indükleyiciler olarak rolünü araştırmıştır. Sonuçlar, bu nanopartiküllerin enzimatik uyarım yoluyla hesperidin biyosentezinde yer alan genleri aktive edebildiğini ve bu bileşiğin birikiminin artmasına yol açtığını göstermiştir (Şekil 2). Bu nedenle, doğal koşullar altında yetişen bitkilerle karşılaştırıldığında, orta düzeyde stresin ikincil metabolitlerin biyosentezinde yer alan genlerin aktivasyonuyla birleştirilmesi durumunda, bu tür bileşiklerin in vivo üretiminin de artırılabileceği ileri sürülebilir. Kombinasyon tedavileri genellikle rejenerasyon oranı üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir, ancak bazı durumlarda bu etki zayıflar. Özellikle, 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaz ve farklı konsantrasyonlarla yapılan tedavi, kontrol grubuna kıyasla rejenerasyon oranını bağımsız olarak ve önemli ölçüde %50,85 oranında artırabilir (Şekil 4c). Bu sonuçlar, nanohormonların belirli kombinasyonlarının bitki büyümesini ve metabolit üretimini teşvik etmek için sinerjik olarak hareket edebileceğini göstermektedir; bu da tıbbi bitkilerin doku kültürü için büyük önem taşımaktadır. Palmer ve Keller [50], 2,4-D tedavisinin St. perforatum'da kallus oluşumunu bağımsız olarak indükleyebildiğini, kinaz ilavesinin ise kallus oluşumunu ve rejenerasyonu önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Bu etki, hormonal dengenin iyileştirilmesi ve hücre bölünmesinin uyarılmasından kaynaklanmaktadır. Bal ve ark. [51], Fe₃O₄-NP tedavisinin antioksidan enzimlerin işlevini bağımsız olarak artırabildiğini ve böylece St. perforatum'da kök büyümesini teşvik edebildiğini bulmuştur. 0,5 mg/L, 1 mg/L ve 1,5 mg/L konsantrasyonlarında Fe₃O₄ nanopartikülleri içeren kültür ortamları, keten bitkilerinin rejenerasyon oranını iyileştirmiştir [52]. Kinetin, 2,4-diklorobenzotiyazolinon ve Fe₃O₄ nanopartiküllerinin kullanımı, kallus ve kök oluşum oranlarını önemli ölçüde iyileştirmiştir; ancak, bu hormonların in vitro rejenerasyon için kullanılmasının potansiyel yan etkileri dikkate alınmalıdır. Örneğin, 2,4-diklorobenzotiyazolinon veya kinetinin uzun süreli veya yüksek konsantrasyonlu kullanımı, somatik klonal varyasyona, oksidatif strese, anormal kallus morfolojisine veya vitrifikasyona neden olabilir. Bu nedenle, yüksek bir rejenerasyon oranı, genetik stabiliteyi mutlaka öngörmez. Tüm rejenere bitkiler, homojenliklerini ve in vivo bitkilere benzerliklerini belirlemek için moleküler belirteçler (örneğin RAPD, ISSR, AFLP) veya sitogenetik analiz kullanılarak değerlendirilmelidir [53,54,55].
Bu çalışma, bitki büyüme düzenleyicilerinin (2,4-D ve kinetin) Fe₃O₄ nanopartikülleriyle birlikte kullanımının, *Hypericum perforatum* bitkisinde morfojenez ve temel biyoaktif metabolitlerin (hiperisin ve hiperosid dahil) birikimini artırabileceğini ilk kez göstermiştir. Optimize edilmiş tedavi rejimi (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs), sadece kallus oluşumunu, organogenezi ve ikincil metabolit verimini en üst düzeye çıkarmakla kalmamış, aynı zamanda bitkinin stres toleransını ve tıbbi değerini potansiyel olarak iyileştiren hafif bir indükleyici etki de göstermiştir. Nanoteknoloji ve bitki doku kültürünün birleşimi, tıbbi bileşiklerin büyük ölçekli in vitro üretimi için sürdürülebilir ve verimli bir platform sağlamaktadır. Bu sonuçlar, endüstriyel uygulamalar ve moleküler mekanizmalar, doz optimizasyonu ve genetik hassasiyet üzerine gelecekteki araştırmaların önünü açarak, tıbbi bitkiler üzerindeki temel araştırmaları pratik biyoteknolojiyle ilişkilendirmektedir.
Yayın tarihi: 12 Aralık 2025