Antihelmintik ilaç N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE'yi (asetilkolinesteraz) inhibe ettiği ve aşırı vaskülarizasyon nedeniyle potansiyel kanserojen özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu makalede, DEET'in anjiyogenezi teşvik eden endotel hücrelerini özel olarak uyardığını ve böylece tümör büyümesini artırdığını gösteriyoruz. DEET, proliferasyon, göç ve adezyon dahil olmak üzere anjiyogeneze yol açan hücresel süreçleri aktive eder. Bu, endotel hücrelerinde artan NO üretimi ve VEGF ekspresyonu ile ilişkilidir. M3'ün susturulması veya farmakolojik M3 inhibitörlerinin kullanılması tüm bu etkileri ortadan kaldırarak, DEET kaynaklı anjiyogenezin M3'e duyarlı olduğunu göstermektedir. M3 reseptörlerini aşırı ifade eden endotel ve HEK hücrelerinde kalsiyum sinyallemesini içeren deneyler ve bağlanma ve yerleştirme çalışmaları, DEET'in M3 reseptörlerinin allosterik bir modülatörü olarak hareket ettiğini göstermektedir. Dahası, DEET AChE'yi inhibe ederek asetilkolinin biyoyararlanımını ve M3 reseptörlerine bağlanmasını artırır ve allosterik düzenleme yoluyla proanjiyojenik etkileri güçlendirir.
Birincil EK'ler İsviçre farelerinin aortundan izole edildi. Çıkarma yöntemi Kobayashi protokolünden uyarlandı 26. Fare EK'leri dördüncü pasaja kadar %5 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş EBM-2 ortamında kültürlendi.
DEET'in iki konsantrasyonunun HUVEC, U87MG veya BF16F10'un çoğalması üzerindeki etkisi CyQUANT Hücre Çoğalması Testi Kiti (Molecular Probes, C7026) kullanılarak analiz edildi. Kısaca, kuyu başına 5.103 hücre 96 kuyulu bir plakaya ekildi, bir gece boyunca tutunmaya bırakıldı ve ardından 24 saat boyunca DEET ile işlendi. Büyüme ortamını çıkardıktan sonra, mikro plakanın her bir kuyusuna boya bağlayıcı solüsyon ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Floresan seviyeleri, 485 nm uyarma filtreleri ve 530 nm emisyon filtreleri ile donatılmış bir Mithras LB940 çok modlu mikro plaka okuyucusu (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almanya) kullanılarak belirlendi.
HUVEC, kuyu başına 104 hücre yoğunluğunda 96 kuyulu plakalara ekildi. Hücreler 24 saat boyunca DEET ile muamele edildi. Hücre canlılığı, kolorimetrik bir MTT testi (Sigma-Aldrich, M5655) kullanılarak değerlendirildi. Optik yoğunluk değerleri, 570 nm dalga boyunda çok modlu bir mikro plaka okuyucuda (Mithras LB940) elde edildi.
DEET'in etkileri in vitro anjiyogenez analizleri kullanılarak incelenmiştir. 10-8 M veya 10-5 M DEET ile tedavi, HUVEC'lerde kılcal uzunluk oluşumunu artırmıştır (Şekil 1a, b, beyaz çubuklar). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, 10-14 ila 10-5 M arasında değişen DEET konsantrasyonları ile tedavi, kılcal uzunluğun 10-8 M DEET'te bir platoya ulaştığını göstermiştir (Ek Şekil S2). 10-8 M ve 10-5 M konsantrasyon aralığında DEET ile tedavi edilen HUVEC'lerin in vitro proanjiyojenik etkisinde anlamlı bir fark bulunmamıştır.
DEET'in neovaskülarizasyon üzerindeki etkisini belirlemek için in vivo neovaskülarizasyon çalışmaları gerçekleştirdik. 14 gün sonra, 10-8 M veya 10-5 M DEET ile önceden kültürlenmiş endotel hücreleri enjekte edilen farelerde hemoglobin içeriğinde önemli bir artış görüldü (Şekil 1c, beyaz çubuklar).
Ayrıca, DEET kaynaklı neovaskülarizasyon, plazma konsantrasyonlarını 10-5 M'ye çıkardığı bilinen bir dozda günlük (ip) DEET enjekte edilen U87MG ksenograft taşıyan farelerde incelendi; bu, maruz kalan insanlarda normaldir. 23'te. Saptanabilir tümörler (yani tümörler >100 mm3), U87MG hücrelerinin farelere enjekte edilmesinden 14 gün sonra gözlemlendi. 28. günde, tümör büyümesi, DEET ile tedavi edilen farelerde kontrol farelerine kıyasla önemli ölçüde arttı (Şekil 1d, kareler). Ayrıca, tümörlerin CD31 boyama, DEET'in kılcal alanı önemli ölçüde artırdığını ancak mikro damar yoğunluğunu artırmadığını gösterdi. (Şekil 1e–g).
DETA kaynaklı proliferasyonda muskarinik reseptörlerin rolünü belirlemek için, pFHHSiD (10-7 M, seçici bir M3 reseptör antagonisti) varlığında 10-8 M veya 10-5 M DETA kullanıldı. HUVEC tedavisi. pFHHSiD, tüm konsantrasyonlarda DETA'nın proliferatif özelliklerini tamamen bloke etti (Tablo 1).
Bu koşullar altında, DEET'in HUVEC hücrelerinde kılcal uzunluğu artırıp artırmayacağını da inceledik. Benzer şekilde, pFHHSiD DEET kaynaklı kılcal uzunluğu önemli ölçüde engelledi (Şekil 1a, b, gri çubuklar). Ayrıca, M3 siRNA ile benzer deneyler yapıldı. Kontrol siRNA kılcal oluşumu desteklemede etkili olmasa da, M3 muskarinik reseptörünün susturulması DEET'in kılcal uzunluğu artırma yeteneğini ortadan kaldırdı (Şekil 1a, b, siyah çubuklar).
Ayrıca, hem 10-8 M hem de 10-5 M DEET'in indüklediği in vitro vaskülarizasyon hem de in vivo neovaskülarizasyon pFHHSiD tarafından tamamen bloke edildi (Şekil 1c, d, daireler). Bu sonuçlar, DEET'in seçici M3 reseptör antagonistlerine veya M3 siRNA'ya duyarlı bir yol aracılığıyla anjiyogenezi desteklediğini göstermektedir.
AChE, DEET'in moleküler hedefidir. AChE inhibitörleri olarak etki eden donepezil gibi ilaçlar, in vitro ve fare arka bacak iskemi modellerinde EC anjiyogenezini uyarabilir14. HUVEC'te iki DEET konsantrasyonunun AChE enzim aktivitesi üzerindeki etkisini test ettik. Düşük (10-8 M) ve yüksek (10-5 M) DEET konsantrasyonları, kontrol koşullarına kıyasla endotelyal AChE aktivitesini azalttı (Şekil 2).
Her iki DEET konsantrasyonu da (10-8 M ve 10-5 M) HUVEC üzerindeki asetilkolinesteraz aktivitesini azalttı. BW284c51 (10-5 M), asetilkolinesteraz inhibitörleri için bir kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, iki DEET konsantrasyonuyla tedavi edilen HUVEC üzerindeki AChE aktivitesinin taşıyıcıyla tedavi edilen hücrelere kıyasla yüzdesi olarak ifade edilir. Değerler, altı bağımsız deneyin ortalaması ± SEM olarak ifade edilir. *p < 0,05, kontrole kıyasla (Kruskal-Wallis ve Dunn çoklu karşılaştırma testi).
Nitrik oksit (NO) anjiyojenik süreçte yer alır 33, bu nedenle DEET ile uyarılan HUVEC'lerde NO üretimi incelenmiştir. DEET ile tedavi edilen endotelyal NO üretimi kontrol hücrelerine kıyasla artmıştır, ancak yalnızca 10-8 M dozunda anlamlı düzeye ulaşmıştır (Şekil 3c). DEET ile indüklenen NO üretimini kontrol eden moleküler değişiklikleri belirlemek için eNOS ekspresyonu ve aktivasyonu Western blotting ile analiz edilmiştir. DEET tedavisi eNOS ekspresyonunu değiştirmemiş olsa da, eNOS fosforilasyonunda tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla aktive edici bölgesinde (Ser-1177) eNOS fosforilasyonunu önemli ölçüde artırırken inhibitör bölgesini (Thr-495) azaltmıştır (Şekil 3d). Ayrıca, aktivasyon bölgesindeki ve inhibitör bölgedeki fosforile edilmiş eNOS oranı, fosforile edilmiş eNOS miktarının toplam enzim miktarına göre normalleştirilmesinden sonra hesaplanmıştır. Bu oran, DEET'in her konsantrasyonuyla tedavi edilen HUVEC'lerde, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3d).
Son olarak, ana proanjiyogenik faktörlerden biri olan VEGF'nin ekspresyonu Western blotting ile analiz edildi. DEET, VEGF ekspresyonunu önemli ölçüde artırırken, pFHHSiD bu ekspresyonu tamamen bloke etti.
DEET'in etkileri hem farmakolojik blokaja hem de M3 reseptörlerinin aşağı regülasyonuna duyarlı olduğundan, DEET'in kalsiyum sinyallemesini artırabileceği hipotezini test ettik. Şaşırtıcı bir şekilde, DEET kullanılan her iki konsantrasyon için de HUVEC'te (veri gösterilmemiştir) ve HEK/M3'te (Şekil 4a, b) sitoplazmik kalsiyumu artırmada başarısız oldu.
Gönderi zamanı: 30-Aralık-2024