Anthelmintik ilaç N,N-dietil-m-toluamid (DEETDEET'in (digliserit), asetilkolinesterazı (AChE) inhibe ettiği ve aşırı vaskülarizasyon nedeniyle potansiyel kanserojen özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, DEET'in özellikle anjiyogenezi destekleyen endotel hücrelerini uyardığını ve böylece tümör büyümesini artırdığını gösteriyoruz. DEET, proliferasyon, göç ve yapışma dahil olmak üzere anjiyogeneze yol açan hücresel süreçleri aktive eder. Bu, endotel hücrelerinde artan NO üretimi ve VEGF ekspresyonu ile ilişkilidir. M3'ün susturulması veya farmakolojik M3 inhibitörlerinin kullanılması, tüm bu etkileri ortadan kaldırmıştır; bu da DEET kaynaklı anjiyogenezin M3'e duyarlı olduğunu düşündürmektedir. Endotel ve M3 reseptörlerini aşırı ifade eden HEK hücrelerinde kalsiyum sinyallemesi ile ilgili deneyler ve bağlanma ve kenetlenme çalışmaları, DEET'in M3 reseptörlerinin allosterik bir modülatörü olarak hareket ettiğini göstermektedir. Ayrıca, DEET, AChE'yi inhibe ederek asetilkolinin biyoyararlanımını ve M3 reseptörlerine bağlanmasını artırır ve allosterik düzenleme yoluyla proanjiyojenik etkileri güçlendirir.
Birincil endotel hücreleri (EC'ler), İsviçre farelerinin aortundan izole edildi. Ekstraksiyon yöntemi, Kobayashi protokolünden 26 uyarlanmıştır. Fare endotel hücreleri, dördüncü pasajına kadar %5 ısı ile inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş EBM-2 ortamında kültüre edildi.
İki farklı DEET konsantrasyonunun HUVEC, U87MG veya BF16F10 hücrelerinin çoğalması üzerindeki etkisi, CyQUANT Hücre Çoğalma Test Kiti (Molecular Probes, C7026) kullanılarak analiz edildi. Kısaca, 96 kuyucuklu bir plakaya kuyu başına 5.103 hücre ekildi, gece boyunca yapışmaları sağlandı ve ardından 24 saat boyunca DEET ile muamele edildi. Büyüme ortamı çıkarıldıktan sonra, mikroplakanın her bir kuyucuğuna boya bağlama çözeltisi eklendi ve hücreler 37 °C'de 30 dakika inkübe edildi. Floresans seviyeleri, 485 nm uyarıcı filtreler ve 530 nm emisyon filtreleri ile donatılmış bir Mithras LB940 çok modlu mikroplaka okuyucu (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almanya) kullanılarak belirlendi.
HUVEC hücreleri, kuyu başına 104 hücre yoğunluğunda 96 kuyucuklu plaklara ekildi. Hücreler 24 saat boyunca DEET ile muamele edildi. Hücre canlılığı, kolorimetrik MTT testi (Sigma-Aldrich, M5655) kullanılarak değerlendirildi. Optik yoğunluk değerleri, 570 nm dalga boyunda çok modlu bir mikroplaka okuyucu (Mithras LB940) ile elde edildi.
DEET'in etkileri in vitro anjiyogenez testleri kullanılarak incelenmiştir. 10-8 M veya 10-5 M DEET ile tedavi, HUVEC'lerde kılcal damar uzunluğunun oluşumunu artırmıştır (Şekil 1a, b, beyaz çubuklar). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 10-14 ila 10-5 M arasında değişen DEET konsantrasyonlarıyla yapılan tedavi, kılcal damar uzunluğunun 10-8 M DEET'te bir platoya ulaştığını göstermiştir (Ek Şekil S2). 10-8 M ve 10-5 M konsantrasyon aralığında DEET ile tedavi edilen HUVEC'lerin in vitro proanjiyojenik etkisinde anlamlı bir fark bulunmamıştır.
DEET'in neovaskülarizasyon üzerindeki etkisini belirlemek için, in vivo neovaskülarizasyon çalışmaları gerçekleştirdik. 14 gün sonra, 10-8 M veya 10-5 M DEET ile önceden kültüre edilmiş endotel hücreleri enjekte edilen farelerde hemoglobin içeriğinde önemli bir artış gözlendi (Şekil 1c, beyaz çubuklar).
Ayrıca, DEET'in neden olduğu neovaskülarizasyon, maruz kalan insanlarda normal olan 10-5 M plazma konsantrasyonlarını indüklediği bilinen bir dozda DEET'in günlük (ip) olarak enjekte edildiği U87MG ksenogreft taşıyan farelerde incelenmiştir. 23. U87MG hücrelerinin farelere enjeksiyonundan 14 gün sonra saptanabilir tümörler (yani 100 mm3'ten büyük tümörler) gözlemlenmiştir. 28. günde, DEET ile tedavi edilen farelerde tümör büyümesi kontrol farelerine kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1d, kareler). Ayrıca, tümörlerin CD31 boyaması, DEET'in kılcal damar alanını önemli ölçüde artırdığını, ancak mikro damar yoğunluğunu artırmadığını göstermiştir (Şekil 1e-g).
DETA'nın neden olduğu proliferasyonda muskarinik reseptörlerin rolünü belirlemek için, pFHHSiD (10-7 M, seçici bir M3 reseptör antagonisti) varlığında 10-8 M veya 10-5 M DETA kullanıldı. HUVEC'lerin tedavisi. pFHHSiD, tüm konsantrasyonlarda DETA'nın proliferatif özelliklerini tamamen bloke etti (Tablo 1).
Bu koşullar altında, DEET'in HUVEC hücrelerinde kılcal damar uzunluğunu artırıp artırmayacağını da inceledik. Benzer şekilde, pFHHSiD, DEET'in neden olduğu kılcal damar uzunluğunu önemli ölçüde engelledi (Şekil 1a, b, gri çubuklar). Ayrıca, M3 siRNA ile benzer deneyler yapıldı. Kontrol siRNA'sı kılcal damar oluşumunu teşvik etmede etkili olmasa da, M3 muskarinik reseptörünün susturulması, DEET'in kılcal damar uzunluğunu artırma yeteneğini ortadan kaldırdı (Şekil 1a, b, siyah çubuklar).
Ayrıca, hem 10-8 M hem de 10-5 M DEET'in in vitro vaskülarizasyon ve in vivo neovaskülarizasyon, pFHHSiD tarafından tamamen bloke edildi (Şekil 1c, d, daireler). Bu sonuçlar, DEET'in anjiyogenezi, seçici M3 reseptör antagonistlerine veya M3 siRNA'ya duyarlı bir yol aracılığıyla desteklediğini göstermektedir.
AChE, DEET'in moleküler hedefidir. AChE inhibitörü olarak işlev gören donepezil gibi ilaçlar, in vitro ve fare arka bacak iskemi modellerinde EC anjiyogenezini uyarabilir14. HUVEC'lerde iki farklı DEET konsantrasyonunun AChE enzim aktivitesi üzerindeki etkisini test ettik. Düşük (10-8 M) ve yüksek (10-5 M) DEET konsantrasyonları, kontrol koşullarına kıyasla endotel AChE aktivitesini azalttı (Şekil 2).
DEET'in her iki konsantrasyonu da (10-8 M ve 10-5 M) HUVEC'lerde asetilkolinesteraz aktivitesini azalttı. BW284c51 (10-5 M) asetilkolinesteraz inhibitörleri için kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, iki DEET konsantrasyonu ile muamele edilen HUVEC'lerdeki AChE aktivitesinin, taşıyıcı madde ile muamele edilen hücrelere kıyasla yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Değerler, altı bağımsız deneyin ortalama ± standart hata değeri olarak ifade edilmiştir. *p < 0,05 kontrol ile karşılaştırıldığında (Kruskal-Wallis ve Dunn çoklu karşılaştırma testi).
Nitrik oksit (NO), anjiyojenik süreçte rol oynar 33; bu nedenle, DEET ile uyarılan HUVEC'lerde NO üretimi incelenmiştir. DEET ile tedavi edilen endotel hücrelerinde NO üretimi kontrol hücrelerine kıyasla artmıştır, ancak anlamlılık düzeyine yalnızca 10-8 M dozunda ulaşmıştır (Şekil 3c). DEET kaynaklı NO üretimini kontrol eden moleküler değişiklikleri belirlemek için, eNOS ekspresyonu ve aktivasyonu Western blot yöntemiyle analiz edilmiştir. DEET tedavisi eNOS ekspresyonunu değiştirmese de, eNOS fosforilasyonunda tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla aktivasyon bölgesindeki (Ser-1177) fosforilasyonu önemli ölçüde artırırken, inhibisyon bölgesindeki (Thr-495) fosforilasyonu azaltmıştır (Şekil 3d). Ayrıca, fosforile edilmiş eNOS miktarı toplam enzim miktarına normalize edildikten sonra, aktivasyon bölgesindeki ve inhibisyon bölgesindeki fosforile edilmiş eNOS oranı hesaplanmıştır. Bu oran, DEET'in her konsantrasyonuyla tedavi edilen HUVEC'lerde, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3d).
Son olarak, ana anjiyogenez faktörlerinden biri olan VEGF'nin ekspresyonu Western blot yöntemiyle analiz edildi. DEET, VEGF ekspresyonunu önemli ölçüde artırırken, pFHHSiD bu ekspresyonu tamamen bloke etti.
DEET'in etkileri hem farmakolojik blokaj hem de M3 reseptörlerinin aşağı regülasyonuna duyarlı olduğundan, DEET'in kalsiyum sinyallemesini artırabileceği hipotezini test ettik. Şaşırtıcı bir şekilde, DEET, kullanılan her iki konsantrasyonda da HUVEC'te (veriler gösterilmemiştir) ve HEK/M3'te (Şekil 4a, b) sitoplazmik kalsiyumu artırmada başarısız oldu.
Yayın tarihi: 30 Aralık 2024