Antihelmintik ilaç N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE'yi (asetilkolinesteraz) inhibe ettiği ve aşırı vaskülarizasyon nedeniyle potansiyel kanserojen özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu makalede, DEET'in anjiyogenezi teşvik eden endotel hücrelerini spesifik olarak uyararak tümör büyümesini artırdığını gösteriyoruz. DEET, proliferasyon, göç ve adezyon dahil olmak üzere anjiyogeneze yol açan hücresel süreçleri aktive eder. Bu, endotel hücrelerinde NO üretiminin ve VEGF ekspresyonunun artmasıyla ilişkilidir. M3'ün susturulması veya farmakolojik M3 inhibitörlerinin kullanılması tüm bu etkileri ortadan kaldırarak, DEET kaynaklı anjiyogenezin M3'e duyarlı olduğunu düşündürmektedir. M3 reseptörlerini aşırı eksprese eden endotel ve HEK hücrelerinde kalsiyum sinyallemesini içeren deneyler ve bağlanma ve yerleştirme çalışmaları, DEET'in M3 reseptörlerinin allosterik bir modülatörü olarak hareket ettiğini göstermektedir. Dahası, DEET AChE'yi inhibe ederek asetilkolinin biyoyararlanımını ve M3 reseptörlerine bağlanmasını artırır ve allosterik düzenleme yoluyla proanjiyojenik etkileri güçlendirir.
Birincil EK'ler, İsviçre farelerinin aortundan izole edildi. Ekstraksiyon yöntemi Kobayashi protokolünden uyarlandı 26. Fare EK'leri, dördüncü pasaja kadar %5 ısıyla inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş EBM-2 ortamında kültüre edildi.
İki farklı DEET konsantrasyonunun HUVEC, U87MG veya BF16F10 proliferasyonu üzerindeki etkisi, CyQUANT Hücre Proliferasyon Testi Kiti (Molecular Probes, C7026) kullanılarak analiz edildi. Özetle, kuyu başına 5,103 hücre 96 kuyulu bir plakaya ekildi, bir gece boyunca bağlanmaya bırakıldı ve ardından 24 saat DEET ile muamele edildi. Büyüme ortamı çıkarıldıktan sonra, mikro plakanın her bir kuyusuna boya bağlayıcı solüsyon ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Floresan seviyeleri, 485 nm uyarma filtreleri ve 530 nm emisyon filtreleriyle donatılmış bir Mithras LB940 çok modlu mikro plaka okuyucu (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almanya) kullanılarak belirlendi.
HUVEC, kuyu başına 104 hücre yoğunluğunda 96 kuyulu plakalara ekildi. Hücreler 24 saat boyunca DEET ile muamele edildi. Hücre canlılığı, kolorimetrik bir MTT testi (Sigma-Aldrich, M5655) kullanılarak değerlendirildi. Optik yoğunluk değerleri, 570 nm dalga boyunda çok modlu bir mikro plaka okuyucuda (Mithras LB940) elde edildi.
DEET'in etkileri in vitro anjiyogenez testleri kullanılarak incelenmiştir. 10-8 M veya 10-5 M DEET ile tedavi, HUVEC'lerde kılcal uzunluk oluşumunu artırmıştır (Şekil 1a, b, beyaz çubuklar). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 10-14 ila 10-5 M arasında değişen DEET konsantrasyonlarıyla tedavi, kılcal uzunluğun 10-8 M DEET'te bir platoya ulaştığını göstermiştir (Ek Şekil S2). 10-8 M ve 10-5 M konsantrasyon aralığında DEET ile tedavi edilen HUVEC'lerin in vitro proanjiyojenik etkisinde anlamlı bir fark bulunmamıştır.
DEET'in neovaskülarizasyon üzerindeki etkisini belirlemek için in vivo neovaskülarizasyon çalışmaları gerçekleştirdik. 14 gün sonra, 10-8 M veya 10-5 M DEET ile önceden kültürlenmiş endotel hücreleri enjekte edilen farelerde hemoglobin içeriğinde önemli bir artış görüldü (Şekil 1c, beyaz çubuklar).
Ayrıca, DEET kaynaklı neovaskülarizasyon, plazma konsantrasyonlarını 10-5 M'ye çıkardığı bilinen bir dozda günlük (ip) DEET enjekte edilen U87MG ksenograft taşıyan farelerde incelenmiştir; bu doz, maruz kalan insanlarda normaldir. 23'te. U87MG hücrelerinin farelere enjeksiyonundan 14 gün sonra saptanabilir tümörler (yani >100 mm3 tümörler) gözlemlendi. 28. günde, tümör büyümesi DEET ile tedavi edilen farelerde kontrol farelerine kıyasla önemli ölçüde artmıştı (Şekil 1d, kareler). Ayrıca, tümörlerin CD31 boyaması, DEET'in kılcal alanı önemli ölçüde artırdığını ancak mikro damar yoğunluğunu artırmadığını göstermiştir. (Şekil 1e–g).
DETA kaynaklı proliferasyonda muskarinik reseptörlerin rolünü belirlemek için, pFHHSiD (seçici bir M3 reseptör antagonisti olan 10-7 M) varlığında 10-8 M veya 10-5 M DETA kullanıldı. HUVEC tedavisi, tüm konsantrasyonlarda DETA'nın proliferatif özelliklerini tamamen bloke etti (Tablo 1).
Bu koşullar altında, DEET'in HUVEC hücrelerinde kılcal damar uzunluğunu artırıp artırmadığını da inceledik. Benzer şekilde, pFHHSiD, DEET kaynaklı kılcal damar uzunluğunu önemli ölçüde engelledi (Şekil 1a, b, gri çubuklar). Ayrıca, M3 siRNA ile de benzer deneyler gerçekleştirildi. Kontrol siRNA kılcal damar oluşumunu desteklemede etkili olmasa da, M3 muskarinik reseptörünün susturulması, DEET'in kılcal damar uzunluğunu artırma yeteneğini ortadan kaldırdı (Şekil 1a, b, siyah çubuklar).
Ayrıca, hem 10-8 M hem de 10-5 M DEET ile indüklenen in vitro vaskülarizasyon hem de in vivo neovaskülarizasyon, pFHHSiD tarafından tamamen bloke edilmiştir (Şekil 1c, d, daireler). Bu sonuçlar, DEET'in seçici M3 reseptör antagonistlerine veya M3 siRNA'ya duyarlı bir yol aracılığıyla anjiyogenezi desteklediğini göstermektedir.
AChE, DEET'in moleküler hedefidir. AChE inhibitörleri olarak etki eden donepezil gibi ilaçlar, in vitro ve fare arka bacak iskemi modellerinde EK anjiyogenezini uyarabilir14. HUVEC'de iki farklı DEET konsantrasyonunun AChE enzim aktivitesi üzerindeki etkisini test ettik. Düşük (10-8 M) ve yüksek (10-5 M) DEET konsantrasyonları, kontrol koşullarına kıyasla endotelyal AChE aktivitesini azalttı (Şekil 2).
Her iki DEET konsantrasyonu da (10-8 M ve 10-5 M), HUVEC üzerindeki asetilkolinesteraz aktivitesini azaltmıştır. BW284c51 (10-5 M), asetilkolinesteraz inhibitörleri için kontrol olarak kullanılmıştır. Sonuçlar, iki DEET konsantrasyonuyla tedavi edilen HUVEC üzerindeki AChE aktivitesinin, taşıyıcıyla tedavi edilen hücrelere kıyasla yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Değerler, altı bağımsız deneyin ortalaması ± SEM olarak ifade edilmiştir. *Kontrol ile karşılaştırıldığında p < 0,05 (Kruskal-Wallis ve Dunn çoklu karşılaştırma testi).
Nitrik oksit (NO) anjiyojenik süreçte rol oynar 33, bu nedenle DEET ile uyarılan HUVEC'lerde NO üretimi incelenmiştir. DEET ile tedavi edilen endotel NO üretimi kontrol hücrelerine kıyasla artmıştır, ancak yalnızca 10-8 M dozunda anlamlı düzeye ulaşmıştır (Şekil 3c). DEET ile indüklenen NO üretimini kontrol eden moleküler değişiklikleri belirlemek için eNOS ekspresyonu ve aktivasyonu Western blot ile analiz edilmiştir. DEET tedavisi eNOS ekspresyonunu değiştirmemiş olsa da, eNOS fosforilasyonunda tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla aktive edici bölgesinde (Ser-1177) eNOS fosforilasyonunu önemli ölçüde artırırken inhibe edici bölgesini (Thr-495) azaltmıştır (Şekil 3d). Ayrıca, aktivasyon bölgesindeki ve inhibe edici bölgedeki fosforile eNOS oranı, fosforile eNOS miktarının toplam enzim miktarına göre normalleştirilmesinden sonra hesaplanmıştır. Bu oran, DEET'in her konsantrasyonuyla muamele edilen HUVEC'lerde, muamele edilmeyen hücrelere kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3d).
Son olarak, ana proanjiyogenik faktörlerden biri olan VEGF ekspresyonu Western blotting ile analiz edildi. DEET, VEGF ekspresyonunu önemli ölçüde artırırken, pFHHSiD bu ekspresyonu tamamen bloke etti.
DEET'in etkileri hem farmakolojik blokaja hem de M3 reseptörlerinin aşağı regülasyonuna duyarlı olduğundan, DEET'in kalsiyum sinyallemesini artırabileceği hipotezini test ettik. Şaşırtıcı bir şekilde, DEET, kullanılan her iki konsantrasyonda da HUVEC'te (veriler gösterilmemiştir) ve HEK/M3'te (Şekil 4a, b) sitoplazmik kalsiyumu artırmada başarısız oldu.
Gönderim zamanı: 30 Aralık 2024