Pestisitler, küresel gıda kıtlığıyla mücadelede ve vektör kaynaklı insan hastalıklarıyla savaşmada kritik bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, pestisit direncindeki artan sorun, az kullanılan hedefleri hedef alan yeni bileşiklerin keşfini acilen gerektirmektedir. Böcek geçici reseptör potansiyeli (TRPV) kanalları – Nanzhong (Nan) ve inaktif (Iav) – heterolog kanallar (Nan-Iav) oluşturabilir ve böceklerde jeotropizm, işitme ve propriosepsiyonu düzenleyen mekanosensör organlara yerleşebilir. Aphidopirrolidon (AP) gibi bazı pestisitler, bilinmeyen mekanizmalar yoluyla Nan-Iav'ı hedef alır. AP, delici-emici böceklere (hemipteranlar) karşı etkilidir ve filamentlerin işlevini bozarak beslenmeyi engeller. AP yalnızca Nan'a bağlanabilir, ancak yalnızca Nan-Iav, endojen nikotinamid (NAM) dahil olmak üzere agonistlerle etkileşime girerek kanal aktivitesi gösterebilir. Nan-Iav'ın böcek ilacı hedefi olarak potansiyeline rağmen, kanal oluşumu, düzenleyici bağlanma bölgeleri ve Ca2+-bağımlı düzenlemesi hakkında çok az şey bilinmektedir; bu da böcek ilacı geliştirme çalışmalarını engellemektedir. Bu çalışmada, Hemiptera böceklerinde Nan-Iav'ın yapısını, kalmodulin ligandı içermeyen durumda ve ayrıca ankirin tekrar sitoplazmik alanının (ARD) sınırında AP ve NAM ile birlikte belirlemek için kriyoelektron mikroskopi kullanılmıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, Nan proteininin kendisinin, AP aracılı ARD etkileşimleriyle stabilize edilen bir pentamer oluşturabildiğini bulduk. Bu çalışma, böcek ilaçları ve agonistler ile Nan-Iav arasındaki moleküler etkileşimleri ortaya koyarak, kanal fonksiyonu ve oluşumunda ARD'nin önemini vurgulamakta ve Ca2+ düzenleme mekanizmasını araştırmaktadır.
Giderek şiddetlenen küresel iklim değişikliği ortamında, küresel gıda güvenliğinin bozulması, toplum üzerinde zincirleme sonuçlar doğuracak şekilde, 21. yüzyılın en büyük zorluklarından biridir.1,2Dünya Sağlık Örgütü'nün 2023 Dünya Gıda Güvenliği ve Beslenme Durumu (SOFI) raporu, dünya genelinde yaklaşık 2,33 milyar insanın orta ila şiddetli düzeyde gıda güvensizliğinden muzdarip olduğunu tahmin ediyor; bu uzun süredir devam eden bir sorun.3,4Ne yazık ki, her yıl mahsul veriminin tahminen %20 ila %30'u veya daha fazlası zararlılar ve patojenler nedeniyle kaybediliyor ve küresel ısınmanın zararlılara karşı direnci ve mahsulün kırılganlığını daha da artırması bekleniyor.4,5,6,7,8Böcek ilacı geliştirme, yalnızca mahsulleri zararlılardan korumak ve vektör kaynaklı patojenlerin yayılmasını azaltmak için değil, aynı zamanda böcek ilaçlarına karşı giderek daha dirençli hale gelen dang humması, sıtma ve Chagas hastalığı gibi vektör kaynaklı insan hastalıklarıyla mücadele etmek için de kritik öneme sahiptir.5,9,10,11
Nörotoksik insektisitlerin başlıca hedefleri arasında, heterotetramerik TRPV kanalı Nanchung (Nan)-İnaktif (Iav), imidacloprid ve pyraclostrobin gibi ticari olarak temin edilebilen insektisitler de dahil olmak üzere, yalnızca son on yılda keşfedilen bir insektisit hedefi sınıfını temsil etmektedir.12,13,14Yarı sentetik insektisit aphidopyrrolifen (AP), ana bileşeni AP'ye subnanomolar aktivite seviyesinde bağlanan aktif insektisit Inscalis® olan, yakın zamanda geliştirilmiş ve ticarileştirilmiş bir üründür.15AP, tozlayıcılara, faydalı böceklere ve diğer hedef olmayan organizmalara karşı düşük akut toksisite gösterir ve etiket talimatlarına uygun kullanıldığında, diğer böcek ilaçlarına karşı direnç baskısını azaltabilir.16,17,18Nan ve Iav, böcek türleri arasında yaygın olarak bulunur, yalnızca anten ve uzuvların kordal gerilme reseptör nöronlarında birlikte ifade edilir ve işitme, yerçekimi algısı ve propriosepsiyon için kritik öneme sahiptir.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid ve pyraclostrobin, benzersiz bir mekanizma aracılığıyla Nan-Iav kompleksini uyararak nihayetinde proprioseptif sinyal iletimini engeller.13,16,23Yaprak bitleri ve beyaz sinekler gibi delici-emici böceklerde (hemipteranlar), propriosepsiyon kaybı beslenme yeteneklerini bozarak nihayetinde ölüme yol açar.13,24İlginç bir şekilde, AP, Nan-Iav kompleksine yüksek, Nan'a ise düşük afinite göstermektedir. AP'nin Nan-Iav'a bağlanması elektriksel bir akım oluştururken, Nan'a tek başına bağlanması kanal aktivitesini uyarmamaktadır. Iav'ın kendisi ise AP'ye hiç bağlanmamaktadır.16Bu durum, Nan ve Iav'ın farklı Nan-Iav kanal kompleksleri oluşturmak üzere bağlanabileceğini (örneğin, farklı stokiyometrik oranlarda veya aynı stokiyometrik oran içinde farklı düzenlemelerle) veya AP'nin birden fazla bölgeye bağlanabileceğini düşündürmektedir. Dahası, doğal agonist nikotinamid (NAM), Drosophila Nan-Iav'a mikromolar afinite ile bağlanarak, in vitro olarak yaprak bitlerine (AP) benzer etkiler göstermektedir.16,25Bu durum, yaprak bitlerinin üremesini ve beslenmesini engeller ve sonuç olarak ölümlerine yol açar.25,26Bu veriler birçok soruyu gündeme getiriyor. Örneğin, Nan-Iav heterodimerinin nasıl oluştuğu, küçük molekülleri modüle etmek için hangi bağlanma bölgelerinin kullanıldığı ve bu küçük moleküllerin propriosepsiyonu baskılayarak kanal fonksiyonunu nasıl düzenlediği hala belirsizliğini koruyor. Ayrıca, Nan'ın kendisinin inaktif olması ve AP'ye düşük afiniteye sahip olması, Nan-Iav heterodimerinin ise aktif olması ve AP'ye daha yüksek afiniteyle bağlanmasının nedenleri de belirsizliğini koruyor. Son olarak, Nan-Iav fonksiyonunun Ca2+-bağımlı düzenlenmesi ve bunun nöronal sinyal süreçlerine nasıl entegre edildiği hakkında çok az şey biliniyor.13,21
Bu çalışmada, kriyoelektron mikroskopi, elektrofizyoloji ve radyoligand bağlanma tekniklerini birleştirerek Nan-Iav'ın oluşumunu ve küçük molekül düzenleyicilerine bağlanma mekanizmasını aydınlattık. Ayrıca, Iav ve AP ile stabilize edilmiş Nan pentamerlerine konstitütif olarak bağlı kalmodulin (CaM) tespit ettik. Bu sonuçlar, kanallardaki kalsiyum iyonlarının düzenlenmesi, kanal oluşumu ve ligand bağlanma afinitesini belirleyen faktörler hakkında önemli bilgiler sağlamaktadır. Daha da önemlisi, ARD'nin bu süreçlerde merkezi bir rol oynadığını doğruladık. İlgili tarım ilaçlarına bağlı komple böcek kanalları üzerine yaptığımız çalışmamız...27, 28, 29Bu durum, pestisit endüstrisinin gelişmesi için yeni olanaklar sunmakta, pestisitlerin etkinliğini ve özgüllüğünü artırmakta ve TRPV'yi hedefleyen bileşiklerin diğer türlere uygulanmasını sağlayarak küresel gıda güvenliği ve vektör kaynaklı hastalıkların yayılmasıyla mücadeleye olanak tanımaktadır.
Ayrıca Nan-Iav'ın Ca2+ tarafından düzenlendiğini ve düzenleme mekanizmasının sürekli bağlı CaM aracılığıyla gerçekleştiğini bulduk. Önemli olarak, Nav'ın CaM tarafından bu Ca2+-bağımlı düzenlenmesi, diğer iyon kanallarının (örneğin, voltaj kapılı Na+ kanalları ve TRPV5/6 kanalları) düzenleme mekanizmalarından önemli ölçüde farklıdır.52,53,54,55,56,57Nav1.2 kanalında, CaM'nin C-terminal alanı, C-terminal alanı (CTD) ile sarmal bir şekilde birleşir ve Ca2+, N-terminal alanının CTD'nin distal kısmına bağlanmasını sağlar.56TRPV5/6 kanalında, CaM'nin C-terminal alanı CTH'ye bağlanır ve Ca2+, N-terminal alanının gözenek içine doğru yukarı doğru uzanmasını sağlayarak katyon geçirgenliğini engeller.53,54Nan-Iav-CaM'nin Ca2+ ile düzenlenen işlevi için bir model öneriyoruz (Şekil 4h). Bu modelde, CaM'nin N-terminal alanı, Iav'nin C-terminal alanına (CTH) sürekli olarak bağlanır. Dinlenme durumunda (düşük [Ca2+] konsantrasyonu), CaM'nin C-terminal alanı Nan ile etkileşime girerek ARD konformasyonunu stabilize eder ve böylece kanal açılmasını teşvik eder. Bir agonist/insektisit kanala bağlandığında gözenek açılır ve bu da Ca2+ girişine yol açar. Ca2+ daha sonra CaM'ye bağlanarak C-terminal alanının Nan'ın ARD'sinden ayrılmasına neden olur. CaM bağlanmasının engellenmesi esasen Ca2+'nin inhibitör etkisini ortadan kaldırdığı için, bu ayrışma ARD hareketliliğini modüle ederek Ca2+-bağımlı inhibisyona veya duyarsızlaşmaya neden olur. Kalsiyum iyonu elüsyonundan sonra kanal akımlarının hızlı bir şekilde toparlanması (Şekil 4g), bu mekanizmanın Ca2+ aracılı nöronal sinyallere hızlı yanıtları kolaylaştırdığını düşündürmektedir. Ayrıca, henüz tam olarak anlaşılamayan Iav'nin C-terminal bölgesinin, kanal hedeflemesi ve akım düzenlemesinde başka roller de oynadığı bildirilmiştir.21
Son olarak, çalışmamız tarımsal öneme sahip bir insektisit-insektisit TRP kanal kompleksinin yüksek çözünürlüklü yapısını sunmaktadır; bu, daha önce bizim için bilinmeyen bir keşiftir. Özellikle, böcek kanalının yapısını ve işlevini böcek hücrelerinde değil, insan hücrelerinde (HEK293S GnTi–) karakterize ettik. Artan insektisit direnci ve gıda güvenliği ile patojenler üzerindeki devam eden baskı karşısında, çalışmamız insan sağlığı ve küresel gıda güvenliği yararına yeni insektisitlerin geliştirilmesini kolaylaştıracak önemli bilgiler sağlamaktadır. Çalışmalar, AP gibi insektisitlerin etiket talimatlarına göre kullanıldığında bazı zararlılara karşı etkili olduğunu ve faydalı tozlayıcılara karşı düşük akut toksisiteye sahip olduğunu, dolayısıyla çevresel güvenliklerini gösterdiğini ortaya koymuştur.13,16Ayrıca, bazı AP türevlerinin sivrisinekler üzerinde test edilmesi, sivrisineklerin sonunda uçma yeteneklerini kaybettiğini göstermiştir. Bu modüle edici bileşiklerin Nan-Iav'ye nasıl bağlandığını anlamak, mevcut bileşiklerin modifikasyonunu veya daha etkili yeni bileşiklerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.kesinHaşere kontrolü. Çalışmamız, Nan-Iav ARD arayüzünün sadece endojen bileşiklerin, pestisitlerin ve Ca2+-CaM'nin aktivitesini düzenlemek için değil, aynı zamanda kanal montajı için de kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir. Heterodimer montajını küçük moleküllerle bozmanın, iyon kanalı inhibitörleri geliştirmek için benzersiz ve umut vadeden bir yaklaşım olabileceğini öne sürüyoruz.
Sekiz ortolog gen arasından, deterjanlarda mükemmel stabilite gösteren kahverengi böcek (Halyomorpha halys) Nanchung ve Inactive'in tam uzunluktaki genleri seçildi. Sentezlenen genler, insan ekspresyonu için kodon optimize edildi ve XhoI ve EcoRI kısıtlama bölgeleri kullanılarak pBacMam pCMV-DEST vektörüne (Life Technologies) klonlandı. Bu, klonların, HRC-3C proteazı (PPX) tarafından kesilen C-terminal GFP-FLAG-10xHis ve mCherry-FLAG-10xHis etiketleriyle aynı çerçevede olmasını sağlayarak bağımsız ekspresyona olanak tanıdı.ifadeNanchung ve Inactive genlerini pBacMam vektörüne klonlamak için kullanılan primerler aşağıdaki gibidir:
Bireysel parçacıkların mikroskobik görüntüleri, K3 kamera ve Gatan BioQuantum enerji filtresi ile donatılmış bir Titan Krios G2 transmisyon elektron mikroskobu (FEI) kullanılarak elde edildi. Mikroskop 300 keV'de, 20 eV enerji ayarında, 1,08 Å/piksel örnek piksel boyutunda (nominal büyütme 81.000x) ve -0,8 ila -2,2 μm arasında değişen bir odaklama gradyanında çalıştırıldı. Video kaydı, 25 e–px−1 s−1 nominal doz hızı, 2,4 s pozlama süresi ve yaklaşık 60 e–Å−2 toplam doz ile bir Latitude S mikroskobu (Gatan) kullanılarak saniyede 40 kare hızında gerçekleştirildi.
RELION 4.061'deki MotionCor2 kullanılarak film üzerinde ışın kaynaklı hareket düzeltmesi ve doz ağırlıklandırması yapıldı. Kontrast transfer fonksiyonu (CTF) parametre tahmini, cryoSPARC'ta yama tabanlı CTF tahmin yöntemi62 kullanılarak gerçekleştirildi. CTF uyum çözünürlüğü ≥4 Å olan fotomikrograflar sonraki analizlerden çıkarıldı. Tipik olarak, cryoSPARC'ta nokta seçimi için 500-1000 fotomikrograftan oluşan bir alt küme kullanıldı, ardından şablon tabanlı parçacık seçimi için net bir referans görüntü elde etmek üzere filtrelemeden sonra birkaç tur 2B sınıflandırma yapıldı. Parçacıklar daha sonra 64 piksellik sınırlayıcı kutular ve 4 katlı binleme kullanılarak çıkarıldı. İstenmeyen parçacık kategorilerini kaldırmak için birkaç tur 2B sınıflandırma yapıldı. İlk 3B model, ab initio yeniden yapılandırma kullanılarak yeniden oluşturuldu ve cryoSPARC'ta tekdüze olmayan iyileştirme kullanılarak iyileştirildi. 3B sınıflandırma, ARD heterojenliğine bağlı olarak cryoSPARC veya RELION'da gerçekleştirildi. Membran alanlarında önemli bir heterojenlik gözlemlenmedi. Parçacıklar C1 ve C2 yöntemleri kullanılarak rafine edildi; daha yüksek C2 çözünürlüğüne sahip parçacıklar C2'ye göre simetrik kabul edildi ve Bayesyen rafine etme için RELION'a aktarıldı. Parçacıklar daha sonra son düzensiz ve yerel rafine etme için cryoSPARC'a geri aktarıldı. Son çözünürlük ve parçacık sayıları Tablo 1'de gösterilmiştir.
Nan+AP pentamerlerini işlerken, özellikle gözenek bölgesi olmak üzere membran alanlarının çözünürlüğünü iyileştirmek için sinyal çıkarma ve TMD maskeleme gibi çeşitli yöntemler araştırdık. Ancak, gözenek bölgesindeki potansiyel aşırı düzensizlik ve TMD'nin genel heterojenliği nedeniyle bu girişimler başarısız oldu. Nihai çözünürlük, öncelikle ARD bölgesini hedefleyen cryoSPARC'taki tekdüze olmayan işleme yöntemi tarafından otomatik olarak oluşturulan bir maske kullanılarak hesaplandı. Bu, membran alanlarına (özellikle VSLD bölgesine) kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir çözünürlük sağladı.
Nanchung ve İnaktif mikroorganizmaların apo formlarının ilk de novo modelleri öncelikle Coot63 kullanılarak oluşturuldu ve Nan ve Iav mikroorganizmalarının modelleri, düşük güvenilirlik bölgelerini belirlemek için AlphaFold264 kullanılarak oluşturuldu. Kalmodulin modellemesi, sırasıyla PDB erişim numaraları 4JPZ56 ve 1CFD65'teki Ca2+-bağlayıcı ve Ca2+-serbest modellerin katı cisim uyumlarına dayanıyordu. Modeller, doğru stereokimya ve iyi geometriyi sağlamak için küresel iyileştirme kullanılarak rafine edildi. Fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin ve fosfatidilserin daha sonra iyi tanımlanmış lipid yoğunlukları olarak modellendi ve NAM ve AP ligandları, sıkı bağlantılardaki karşılık gelen yoğunluklara yerleştirildi. Kısıtlama dosyaları, PHENIX66'daki eLBOW kullanılarak izoformların SMILES dizesinden oluşturuldu. Son olarak, modeller PHENIX'te yerel ızgara araması ve ikincil yapı kısıtlamalarıyla küresel minimizasyon kullanılarak gerçek uzayda iyileştirildi. Model iyileştirme ve yapısal analiz için MolProbity sunucusu kullanıldı ve çizimler PyMOL ve UCSF Chimera X kullanılarak gerçekleştirildi. 67,68,69 Açıklık analizi HOLE sunucusu kullanılarak yapıldı,70 ve dizi koruma haritalaması Consurf sunucusu kullanılarak gerçekleştirildi.71
İstatistiksel analizler Igor Pro 6.2, Excel Office 365 ve GraphPad Prism 7.0 kullanılarak yapılmıştır. Tüm nicel veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak sunulmuştur. İki grubu karşılaştırmak için Student's t-testi (iki yönlü, eşleştirilmemiş) kullanılmıştır. Birden fazla grubu karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Dunnett'in post hoc testi kullanılmıştır. *P< 0,05, **P< 0,01 ve ***P< 0,001 değerleri, veri dağılımına bağlı olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Kd, Ki değerleri ve bunların asimetrik %95 güven aralıkları GraphPad Prism 10 kullanılarak hesaplandı.
Çalışma metodolojisi hakkında daha fazla bilgi için lütfen bu makalede bağlantısı verilen Nature Portfolio Rapor Özeti'ne bakın.
Başlangıç modeli, PDB 4JPZ ve 1CFD veritabanlarındaki kalmodulin modelleri kullanılarak oluşturulmuştur. Koordinatlar, Protein Veri Bankası'na (PDB) 9NVN (ligand içermeyen Nan-Iav-CaM), 9NVO (nikotinamide bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotinamide ve EDTA'ya bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidopirolin ve kalsiyuma bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidopirolin ve EDTA'ya bağlı Nan-Iav-CaM) ve 9NVS (afenidopiroline bağlı Nan pentameri) erişim numaraları altında kaydedilmiştir. İlgili kriyoelektron mikroskopi görüntüleri, Elektron Mikroskopi Veritabanı'na (EMDB) aşağıdaki erişim numaraları altında kaydedilmiştir: EMD-49844 (ligand içermeyen Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (nikotinamid ile komplekslenmiş Nan-Iav-CaM), EMD-49846 (nikotinamid ve EDTA ile komplekslenmiş Nan-Iav-CaM), EMD-49847 (afidopirrolin ve kalsiyum ile komplekslenmiş Nan-Iav-CaM), EMD-49848 (afidopirrolin ve EDTA ile komplekslenmiş Nan-Iav-CaM) ve EMD-49849 (afidopirrolin ile komplekslenmiş Nan pentamer). Fonksiyonel analiz için ham veriler bu makalede sunulmuştur.
Yayın tarihi: 28 Ocak 2026